aldh9a1通过上调tnfaip1抑制肝癌细胞迁移的作用机理研究

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1、分类号：R734.2密级：公开学校代码：11065学号：y0114130142专业博士学位论文ALDH9A1通过上调TNFAIP1抑制肝癌细胞迁移的作用机理研究作者姓名刘士锋指导教师于洪升（教授）专业领域肿瘤学培养单位医学部临床医学部答辩日期2018年5月19日ALDH9A1通过上调TNFAIP1肝癌细胞迁移的作用机理研究摘要背景和目的肝细胞肝癌（HCC）是全球男性第5，女性第7的肿瘤，占所有肝脏肿瘤的85%~90%，而其中一半以上发生在中国，由于发病隐匿，发现时已为晚期，失去手术时机，而且其对化疗药抵抗以及复

2、发率高，导致预后较差，生存期短。肿瘤由肿瘤细胞和肿瘤微环境组成，肿瘤微环境又包括多种细胞因子与肿瘤干细胞组成。肿瘤生物学的研究中最具吸引力的理论之一是肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSC）假说，该理论认为肿瘤干细胞在维持肿瘤的恶性增殖、侵袭、转移和复发等方面中起着决定性作用。在CSCs的生物标志物中，乙醛脱氢酶（ALDH）最为显著。ALDH1和ALDH3受到较多关注，其高表达往往提示预后较差，但对ALDH9A1的研究却少之又少。在新英格兰发表的HCC基因表达谱与预后关系的研究中发现癌旁组织ALDH

3、9A1的表达水平高提示预后良好。曾有研究发现ALDH9A1的1q24.1的变异代表了肾细胞肾癌的潜在风险位点。我们首先通过生物信息学分析ALDH9A1表达量与临床的关系，发现ALDH9A1高表达提示预后良好，进而通过体外、体内实验，发掘ALDH9A1抑制肝癌的机制，从而希望能为肝癌的治疗开辟新途径。方法1.生物学分析ALDH9A1表达量和临床的关系我们通过http://www.oncolnc.org/网站收集了TCGA数据库中肝细胞肝癌患者的ALDH9A1mRNA表达量和病人临床生存期、TNM分期、种族和年龄的

4、相关数据，分析其相关性。此外，我们还通过生物信息学网站（http://merav.wi.mit.edu/）对不同肝癌细胞系的ALDH9A1的表达量进行了分析。2.不同肝癌细胞系中ALDH9A1的表达水平通过RT-PCR检测三种肝癌细胞系Huh-7、HepG2和SK-HEP1以及正常肝细胞系HL-7702的ALDH9A1的表达水平，明确ALDH9A1高表达肝癌细胞系和低表达肝癌细胞系。I3.ALDH9A1对肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响选择ALDH9A1低表达细胞株HepG2，对其转染pcDNA3.1-AL

5、DH9A1质粒使其过表达，再选取ALDH9A1高表达细胞系SK-HEP1，对其siRNA干扰，并检测其mRNA表达水平，筛选出稳定的ALDH9A1过表达和低表达体系。随后采用克隆形成实验、划痕实验和transwell细胞迁移和侵袭实验检验ALDH9A1对肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭的影响。4.生物信息学发掘ALDH9A1抑制肝癌机制我们使用癌症基因组图谱（TCGA）数据集分析了ALDH9A1与其正相关和负相关基因的表达关系，并进一步阐明了ALDH9A1与TNFAIP1、NF-B和Vimentin等基因表达的相关

6、性。5.ALDH9A1对EMT的影响我们选取SK-HEP1细胞系的空白对照、ALDH9A1过表达两种细胞系，采用westernblot检测E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的蛋白表达差异，以明确ALDH9A1对EMT的影响。6.ALDH9A1抑制EMT的机制通过Westernblot方法来检测上下游分子的变化，从而阐明分子之间的相互关系。采用westernblot检测SK-HEP1细胞系的空白对照、ALDH9A1过表达和低表达三种细胞系ALDH9A1、TNFAIP3和NF-B的表达水

7、平。我们通过向SK-HEP1细胞转染siRNA-TNFAIP1和pcDNA3.1-TNFAIP1质粒来阻断和激活TNFAIP1，westernblot检测对照组、干扰组和激活组ALDH9A1、TNFAIP3和NF-B的表达水平。我们通过向SK-HEP1细胞转染siRNA-p65和pcDNA3.1-p65质粒来阻断和激活p65，westernblot检测对照组、干扰组和激活组ALDH9A1、TNFAIP3和NF-B的表达水平。7.体内实验验证ALDH9A1对肝癌的抑制作用将经过筛选后确定稳定转染了siRNA-

8、ALDH9A1和pcDNA3.1-ALDH9A1的SK-HEP1细胞进行常规计数后，每只小鼠注射的细胞总数为1×107。将36只BALB/c裸鼠按照鼠龄随机平均分成3组，把培养状态良好的肝癌细胞系siRNA-ALDH9A1低表达株、pcDNA3.1-ALDH9A1高表达株和未经转染的SK-HEP1细胞系皮下注射打入裸鼠皮下，观察6周后，乙醚麻醉裸鼠无痛处死，实施手术将肿瘤取出，测量II