四株coxa16病毒免疫原性及毒株间交叉保护的比较分析

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1、硕士学位论文学校代码：10023学号：$2010018016四株CoxAl6病毒免疫原性及毒株间交叉保护的比较分析AnanalysisontheimmunogenicityandSSreactivi一‘。fourCoxAl6strainscross-reactivityottoUr0strans所院：医学生物学研究所姓名：谢振锋指导教师：李琦涵刘龙丁导师小组：刘建生副主任技师董承红副主任技师学科专业：免疫学研究方向：病毒免疫学完成日期：2013年5月√嘲螋目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1一Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3一—、．L—JL一日lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5一一、实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11一(一)实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11一(二)实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一16一二、实验结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．27．三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一36．四、小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．42．参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．43．附录一主要缩略词

3、表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯∥53一附录二主要溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．55一至殳谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．一60．研究生简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．61一独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．62—中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文摘要柯萨奇A型16病毒(CoxsackievirusgroupA16，CAl6)属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，是导致手足口病(hand，footandmouthdisease，HFMD)的两大主要病原体之一。以往的研究

4、认为柯萨奇A型16病毒感染人体后常常会表现出无临床症状出现或感染后很少出现重症病例的感染方式，因此人们对其并没有太多的深入研究。近年来关于CAl6感染所致HFMD的报道已显示在防控手足口病的工作中要加深对CAl6研究的重要性，尤其是在某些地区的HFMD重症病例中由CAl6所引起的比例可以占到20％以上，提示我们其致病性愈来愈引起了人们的关注，对CAl6的病原学和免疫学特征的探索已经成为样子疫苗的重要实验基础。本研究通过对近年来我国CAl6分离株进行基因分型，分析CAl6在我国流行的基本分子遗传学信息。选取出4个来自于中国大陆不同地区的CAl6毒株，制备纯化灭活全病毒颗粒，免疫小鼠后研究其在

5、免疫原性和毒株间的交叉抗原方面的特性及差异，以期这些研究结果为以后研发全病毒灭活颗粒CAl6病毒疫苗提供一定的实验研究基础。本研究以CAl6病毒中的VPl核营酸序列为依据对19株CAl6病毒建立种系进化树并进行基因分型后，了解到我国大陆地区现流行的不同CAl6毒株跟于1951分离出的第一株CAl6病毒(国际标准株G10)在分子遗传学上均产生了较大的变化。同时，从CAl6的种系进化树中可以看出我国大陆地区2000年前所流行的CAl6毒株在基因型上属于Bl基因型，而在2000"～2010这10年间则又经历了B2a到B2b基因型的变化，并且2008"--2010年的分离株大部分属于B2b基因型。

6、同时，我们注意到不同的毒株间在核苷酸序列及编码蛋白氨基酸序列上均存在一定的差异，这提示了我们不同的CAl6毒株在抗原表型上也会产生一定的差异。因此我们选择了G20、MY08、KM208和KMM／08这四个来自于中国大陆不同地区的CAl6毒株，研究它们在毒株本身的免疫原性及毒株间交叉抗原的差别。这四个毒株均分离于2008"---2010年间，其中除了KMM／08为B2a基因型外，其他三个毒株均为B2b基因型。在制备抗原时我们将福尔马林灭活后的CAl6病毒通过截留量为100kDa的切向流过滤装置进行浓缩40倍后，用AKTApurifier层析纯化系统进行层析纯化，纯化后的样品经ELISA检测样

7、品中的病毒抗原。纯化好的抗原均以640EU／只的抗原量免疫BALB／c雌性小鼠，每组6只。研究中我们通过WesternBlotting的方法验证了CAl6免疫血清中的中和抗体可以识别CAl6病毒中的结构蛋白、伊1和VP2。在随后对这四株CAl6毒株本身的免疫原性进行比较分析时，我们发现G20、KMM／08和KM208这三个毒株纯化后的灭活病毒颗粒免疫小鼠后均能显示出较好中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文的免疫原性，