资源描述：
《皮质发育不良大鼠差异蛋白筛选和其致痫作用探析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、皮质发育不良大鼠差异蛋白筛选和其致痫作用探析【摘要】目的寻找皮质发育不良大鼠脑组织（皮质和海马）与正常对照组织在不同发育阶段的差异表达蛋白质，探讨这些蛋白质在皮质发育不良所致癫痫发生机制中的作用。方法妊娠晚期（孕17d）Sprague-Dawley大鼠腹腔注射卡莫司汀（15mg/kg）诱导仔鼠皮质发育不良。提取新生期（出生后7d,记作P7）及成年仔鼠（P60）新皮质及海马组织蛋白，运用双向凝胶电泳技术构建卡莫司汀诱导皮质发育不良鼠和正常鼠皮质及海马组织在新生期及成年期的蛋白质表达谱，通过比对分析筛选出差异表达的蛋白质斑点。应用MALDI-TOF-MS技术平台对差异最为显著
2、的部分蛋白进行鉴定。结果在模型组和对照组之间共筛选出57个差异表达蛋白质斑点（P皮质发育不良（Corticaldysplasia,CD）是难治性癫痫的重要病因之一，但CD的致痫机制仍有待进一步阐释。比较蛋白质组学技术是一种新型的髙通量差异蛋白筛查技术，正在逐步运用到神经病学研究的各个领域。我们采用卡莫司汀诱导的CD大鼠模型，运用双向电泳技术对比分析CD大鼠和正常大鼠皮质及海马组织在不同发育时期（新生期和成年期）的蛋白质表达谱，筛选出差异表达的蛋白质斑点并应用MALDI-TOF-MS技术平台进行鉴定，以期进一步探讨皮质发育不良癫痫易感性的发生机制并发现新的治疗靶点。1材料与
3、方法1.1动物模型的建立与实验分组健康怀孕Sprague-Dawley大鼠5只由浙江中医药大学实验动物中心提供，孕］7d（Embryonicday17,E17）,体质量270〜320go于E17随机选取3只孕鼠腹腔内注射卡莫司汀（天津金耀制药厂），给药剂量为15mg/kg,E22仔鼠出生，所产雄性仔鼠存活11只归入模型组；余下2只孕鼠在同一天腹腔内注射同等剂量生理盐水，所产雄性仔鼠存活16只入对照组。仔鼠出生当天记作P0,到P21与母鼠分开饲养。P7随机（随机数字法）选取模型组和对照组仔鼠各3只，行病理切片对照检查验证制模成功。1.2蛋白质样品的制备与双向凝胶电泳在P7和
4、P60分别随机（随机数字法）选取模型鼠和对照鼠各3只，留取前额部分新皮质并分离海马组织［1］,所得标本液氮中速冻后-80工保存。取大约300mg样本，PBS清洗后切碎成1mm3见方的小块，转移至匀浆器中，加入2D裂解液（9.5mol/L尿素，65mmol/LDTT,4%CHAPS,0.2%IPG缓冲液，按1：50加入蛋白酶抑制剂约1mL,均来自美国sigma公司），匀浆20次，全过程在冰上完成。将匀浆液转入离心管中，超声破碎细胞（80W,5次，每次10s,间隔15s,冰上完成）。12000g离心45min,取上清液蛋白定量后-80£低温保存。双向电泳：上样100ug,IE
5、F为pH3〜10非线性胶条（瑞典Amersham公司），电泳在EttanIPGphorIsoelectrieFocusingSystem和HoferSE600（美国GEAmersham公司）中进行（电泳条件：30V12h,500V1h,1000V1h,8000V8h,500V4h）,SDS-PAGE为12.5%的胶，先15mA/胶30m,然后换30mA/胶至澳酚蓝离胶下沿0.5cm）。每个样品常规进行3次双向电泳，银染后经UMaxPowerlook2110XL（美国GEAmersham公司）扫描，获得图谱。采用ImageMaster2D软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测
6、和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。1.3质谱扫描与数据库搜索选取并切下差异点（表达量比＞1.8）,做胶内酶解，每个胶粒切碎后放入离心管中，每管加入30〜50UL30mmol/LK3Fe（CN）6:100mmol/LNa2S203=l:1（体积比）脱色，冻干后，加入5PL2・5〜10.0ng/PL测序级Trypsin（Promega）溶液，37£反应过夜，20h左右；吸出酶解液,转移至新管中，原管加入1001L60%ACN/0.1%TFA,超声15min,合并前次溶液，冻干；若有盐，则用Ziptip（美国Millipore公司）进行脱盐。样品与5mg/mLHCC
7、A基质1：1混合后，用4800串联飞行时间质谱仪（美国AppliedBiosystems公司）进行质谱分析，激光源为355nm波长的Nd：YAG激光器，加速电压为2kV,采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据,PMF质量扫描范围为800〜4000U,选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱（MS/MS）分析，每个样品点上选择8个母离子，二级MS/MS激光激发2500次，碰撞能量2kV,CID关闭。质谱结果查NCBI,IPI和EST库。2结果2.1病理验证结果CD组仔鼠P7、P14大脑切片尼氏染色后镜下观察见：皮质变薄，皮层紊
