电镜(2)教学ppt课件

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1、电镜酶细胞化学(clectronmicroscopicenzymecytochemistry)。1、电镜酶细胞化学技术的基本原理细胞内酶存在的特定部位称为酶的定位。酶的细胞化学技术就是通过酶的特异性细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。细胞内酶的定位因酶种类不同而异。底物初级产物最终产物酶反应捕获反应(可溶性)(不溶性)电镜细胞化学术electronmicroscopecytochemistry2、电镜酶细胞化学技术的基本方法（1）取材和固定固定剂:首选混合固定液即多聚甲醛和戊二醛混合配制，它适于同时保存酶活性和超

2、微结构。固定方法:1)直接固定2)灌注固定:可将4％的多聚甲醛或多聚甲醛和戊二醛混合液经血管灌注固定组织，然后取下所需组织，切成长条状组织块；3)直接浸泡固定:手术标本、血细胞、培养细胞等可直接浸泡固定。固定时间:固定液浓度和固定时间必须根据酶的性质、组织种类等因素通过实验来确定。时间一般控制在30分钟左右。（2）切片：固定后的组织，应用缓冲液4℃下漂洗，时间一般在2小时以上，有些酶可漂洗过夜。经缓冲液冲洗后，可直接用冷冻切片机或振动切片机切片，厚度为40～50m，再进行电镜细胞化学反应处理。（3）缓冲液置换将

3、组织置入配制孵育液用的缓冲液中，4℃2～3次，每次5～15分钟，使组织内部建立细胞化学反应所需的pH条件。（4）孵育将组织放在新配制的孵育液中，在振荡恒温水浴箱中孵育。注意:①所用化学药品都要用保证试剂有机纯(GR)，最低也应是分析纯(AR)，特别是底物要求更为严格；②孵育液必须临用前配制；③所用器皿要特别干净，避免和金属接触；④孵育液配好后应再次调整pH；⑤注意最好在振荡恒温水浴箱中孵育，不断振荡孵育液；⑥为了把握好孵育时间和效果，最好在孵育过程中的不同时间取出部分切片进行光镜下检查，以确定孵育时间。（5）组织

4、漂洗：孵育后将标本切片在缓冲液中清洗20～60分钟，一般先用与孵育液同系列的缓冲液，再用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液，以去除附于切片上的各种孵育液试剂。（6）后固定：1%OsO4后固定，4℃，60分钟左右。OsO4不仅起后固定作用，还有锇化作用，以增加图像的反差。（7）超薄切片制备：按常规超薄切片技术进行脱水和包埋。切片厚度不宜太薄，以70～90nm为好。染色要慎重，可先观察未经染色的切片，视需要与否进行电子染色。五、超微结构免疫细胞化学技术超微结构免疫细胞化学技术就是将光镜下的免疫组织化学、免疫细胞化学与各

5、种电镜技术有机地结合起来，在细胞超微结构水平上研究抗原抗体反应，进行抗原的超微水平定性、鉴别和定位的一种技术。包括免疫酶标抗体技术、胶体金标记免疫电镜技术、蛋白A-铁蛋白标记技术等多种技术方法。1．免疫血清和标记物具有特异性高、亲和力强的抗血清是获得理想免疫染色的首要条件。可购买商品提供的抗血清，也可自制免疫血清。标记物应选用电子密度高、与抗体或抗原有亲合力的物质，如胶体金、ProteinA-铁蛋白、辣根过氧化物酶等。免疫组织化学技术免疫电镜术ImmunohistochemistryImmunoelectronm

6、icroscopy2．取材和固定目前常用4%多聚甲醛与低浓度戊二醛混合液。过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛也是一种常用固定剂，3．免疫染色分为包埋前染色和包埋后染色两种。（1）包埋前染色：即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。包埋前染色可分为直接法和间接法两种。2）包埋前染色的特点：①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少

7、的组织，但由于经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定程度的超微结构损伤。（2）包埋后染色组织标本制成超薄切片后，再进行免疫组化染色，又称载网染色。本法的优点是:超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，在同一张切片上可进行多重染色。存在的缺点是:抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱以至丧失；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应，需用氧化剂腐蚀以去除锇和增强树脂的穿透性；包埋在环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质等。操作中的注意事项：a.后固定一般不用OsO4或尽量缩

8、短在OsO4中的停留时间；b.载网应选用镍网或金网；c.在免疫组化处理全过程中，应保持网面湿润，网面干燥会影响抗体活性。4、包埋（1）树脂包埋国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法，可直接脱水后包埋；贴附培养的组织细胞或贴在载片上的半薄切片，可将充满环氧树脂的明胶囊倒置于载片上聚合、硬化，进行原位包埋。包埋后染色，树脂包埋的聚合温度不宜超过50℃，以免影响抗原活性，可采用37℃