最新电镜教学(病毒)ppt教学课件.ppt

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1、一、概述二、病毒学研究中所用电镜样本制作三、临床材料的取样和处理四、病毒的基础研究病毒学的发展历程与电镜技术的发展相辅相成，互相促进。一、概述电镜技术的发展对病毒学发展起了极大的促进作用。在研究病毒侵入宿主细胞后，发生了一系列的变化，又推动电镜技术从简单的形态学观察发展到一个动态的示踪过程。近年来，核酸分子杂交技术，电镜的核酸研究技术进展对病毒的分子生物学研究起了更大的推动作用。电镜可直接观察DNA分子与RNA分子外，还可观察到某些蛋白质与核酸相结合时的复合物二、病毒学研究中所用的电镜样本制作技术（一）负染色技术（二）琼脂扩散技术（三）假复型技术（四）

2、病毒颗粒免疫电镜技术（五）超薄切片电镜技术(六)免疫超薄切片电镜技术（一）负染色技术负染色也叫阴性反差染色。Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用的这种染色技术。用磷钨酸（PTA）对灌木病毒及烟草花叶病毒进行染色后，观察到前所未见的细微结构。1、负染色的原理负染色技术用重金属染液里的金属原子作为电子“染料”，把密度较低的生物标本（病毒）包绕而形成明显反差的方法。电子光束能够通过低电子密度的病毒颗粒，而不能通过金属背景，从而使病毒颗粒呈现出明亮清晰的结构，即负反差。在电镜照片上(与正染色相反)在黑背景中呈现出“白色”的样品。负染色技术目前

3、在病毒形态和结构研究中最为成功。负染色正染色阴性反差染色阳性反差染色细微结构本身不被染色剂与细胞微细结构染色结构周围染色成分相结合背景被染色增加标本结构本身密度散射电子的能力强增加其散射电子能力样品周围成暗色细微结构呈黑色结构本身成像浅未被染色的背景浅淡2、优点（1）负染色技术反差好，分辨率高（可达20Ao左右）（2）简单易行、快速等优点。在生物学研究中广泛的应用主要用于细菌、病毒、分离的细胞器、核酸大分子、蛋白质晶体及其他大分子材料等研究，尤其是在病毒学领域。3.染色剂：1）较高密度：染色剂应具有较高的电子密度和较强的电子散射能力，产生足够的反差。2

4、）溶解度高：优良的染色剂在水中需要有良好的溶解度；染色剂不形成颗粒状结构或析出结晶。3）熔点较高：在电子束照射下不升华挥发；4）分子细小，容易在不规则的样品表面渗透到各个细微角落；5）与样品不发生化学反应；这样才能客观地显示样品的真实形态。凡密度比生物标本大4倍以上的金属溶液均可作为负染色液；在病毒研究中最常使用：1-3%磷钨酸盐水溶液0.1-1%醋酸铀水溶液4.负染色方法：（1）滴染法：样品悬液滴到有支持膜的铜网上将染色剂溶液滴到样品上自然干燥后即可电镜观察（2）漂浮法带有支持膜的铜网，在悬液样品的液滴上漂浮再置于负染液的液滴上漂浮漂浮期间，样品与染

5、液吸附在铜网的支持膜上待干后电镜观察（3）喷雾法样品悬液负染色液等量混合特制喷雾器喷到带有支持膜的铜网上待干后电镜观察优点：雾滴小，样品分布均匀缺点：消耗较多的样品及染料易使病毒扩散，不常用。标本－染液混合染色法：病毒悬液和2％的磷钨酸染液等量混合用毛细管滴到有膜的载网上（吸去过多的病毒－染液混合物），待干后进行电镜观察。一般认为病毒浓度在105以上时不难发现病毒。5.影响因素：1）样品的纯度：负染色样品纯度要求不是很高，最好进行适当纯化；样品杂质太多，如大量的细胞碎片、培养基残渣、糖类、各种盐类结晶均会干扰染色效果及电镜观察。2）样品的浓度：被检查的

6、样品要有适当的浓度。太浓太稀均影响电镜观察。3）样品与染液的均匀分散度为促进样品与染料的均匀分散提高染色效果，可以采用某些分散剂4）悬液与染液的酸碱度一般以中性或略偏酸性（PH6.4－7）为宜。5）染色时机的把握吸去过多样品悬液后尽快滴加负染色液注意：进行负染色观察样品，应多次重复实验，慎重作结论应该做必要的对照，以排除某些假象（二）琼脂扩散技术：检测的材料中病毒含量不足时，为了达到浓缩病毒的目的，并去除材料中所含盐分，可采用琼脂扩散法。用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收，浓缩的病毒

7、沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察。（三）假复型技术：琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，以假复型的形式转移到火棉胶膜上或Formvar膜上。此种方法：能去除标本中的盐分、浓缩病毒；减少不必要的杂质；比较费时。方法：1）将20%的琼脂糖块放到载玻片上，滴上含病毒的悬液，将它放到紫外灯下照射消毒，直到悬液被琼脂吸干。2）在琼脂块的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用滤纸片吸走。3）用刀片将琼脂块的边缘切除（为便于剥离）轻轻将载有琼脂块的载玻片浸入PTA或醋酸铀溶液中，并把Formvar膜剥离和漂浮到染液水面上。4）将铜网放到

8、剥离到水面上的Formvar膜上。5）用不锈钢小柱把铜网膜同Formvar膜一起打捞出来，即可