蛋白抽提protocol(全)lyz

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1、LoadingBuffer煮细胞抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS500ul重悬洗一次，转至500ulEP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按每1×106的细胞加50ulloadingbuffer加入2×loading；5.Vortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，Vortex一下，再甩一下；7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）RIPA裂

2、解抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS1ml重悬洗2次，转至1.5mlEP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按照如下比例加入裂解试剂：RIPA：300ul/1×107细胞PMSF：3ul(1:100)Cocktail：0.3ul(1:1000)5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟Vortex一次；6.4℃预冷离心：10000rpm×10min；7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为2

3、00ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】核，浆蛋白抽提Protocol一.收核-浆蛋白收浆蛋白1.细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）；2.用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；3.去上清，加入ABuffer1mL/1×107cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min，4℃）；4.去上清，加入A’Buffer250uL/1.5×107cell，重悬，4℃放置3mi

4、n，离心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；收核蛋白5.再用A’Buffer500uL/1.5×107cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净；6.剩余沉淀中加入B’Buffer(或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）；7.离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。BufferA的配制：终浓度母液配40Ml(10ml)溶液所需的量HepesPH7.910mM1M400uL(100

5、ul)MgCl21.5mM2M30uL(7.5ul)KCl10mM250mM1.6mL(400ul)DTT0.5mM0.1M200uL(50ul)剩余体积用ddH2O补足至要求体积!BufferA’的配制：BufferA’(2ml)=1960ulBufferA+40uL10%NP-40+20uL10mg/mLPMSF+1uLAprotininBufferA’(1ml)=980ulBufferA+20uL10%NP-40+10uL10mg/mLPMSF+1uLAprotinin（Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的时候可以不加）Buffer

6、B的配制：终浓度母液配40mL(10ml)溶液所需的量HepesPH7.920mM1M800uL(200uL)甘油25%50％20mL(5mL)NaCl0.42M3M5.6mL(1.4mL)EDTA0.2mM0.5M16uL(4uL)DTT0.5mM0.1M200uL(50uL)NP-400.2%10％800uL(200uL)剩余体积用ddH2O补足至要求体积!BufferB’的配制：BufferB’=1mLBufferB+10uL10mg/mLPMSF+0.5uLAprotinin(可以用cockltail代替)核基质蛋白抽提Protocol1、细胞计数（约1×

7、107的细胞），离心（1100rpm×5min）收集细胞；2、用4℃预冷的PBS重悬，将细胞移至1.5mlEP管中，1×PBS洗一遍；3、加300ulRIPA/1×107的细胞，裂解细胞，至冰上15-30min；RIPA＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）4、4℃预冷离心：13000rpm×10-15min；5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5mlEP管，冰上备用(总蛋白)；6、用１×PBS洗管底的pellet×2遍；7、加入Urea-Lysisbuffer10-15ul裂解pellets，vortex10min；8、4℃预冷离心：

8、13000