我国小型猪内源性反转录病毒检测和五指山毒株全长cdna克隆构建

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1、广西大学硕士学位论文我国小型猪内源性反转录病毒的检测与五指山毒株全长cDNA克隆的构建姓名：阳玉彪申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：罗廷荣;章金刚20050601￡里垄兰翌主堂堡鹭文童国小型猪内源性反转录病毒的检测与五指山毒株全长cDNA克隆的构建我国小型猪内源性反转录病毒的检测与五指山毒株全长eDNA克隆的构建摘要猪内源性反转录病毒(PERV)为反转录病毒科(Retroviridae)哺乳动物0型反转录病毒属(MammaJjallTypecRetrovirjdae)成员，它是以前病毒DNA的形式整合进猪细胞基因组中，并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。1997年，

2、Patience等发现PERV在体外可以感染人的多种细胞，引起了人们对PERV与猪一人异种移植病原安全性的广泛关注。因此，本研究利用本实验室已建立的PERV检测方法对我国小型猪中PERV的存在情况进行调查，旨在筛选培育无PERV猪群，为异种移植提供安全可靠的供体源。我们采集了6个省市10个单位、7个品种、17个猪群259份血样，通过POR检测发现：我国小型猪基因组中普遍存在PERV，其阳’『生率达100％。其中以B亚型最高(95．37％)，其次为A亚型(67．18％)、c亚型(40．93％)，目前为止没有筛选到无PERV的阴性猪个体。PERV主要结构蛋白基因gag、poI、en

3、v不仅在小型猪基因组中存在，而且都能够转录为RNA。除了检测不到PERV—c亚型病毒的表达外，大部分A、B亚型病毒都能够检测到表达，且A亚型的表达率高于B亚型。值得注意的是我国小型猪中各种PERV亚型病毒混合存在的现象十分普遍，有78．38％存在2种以上PERV亚型病毒混合感染。鉴于PERV存在的普遍性与广泛性，筛选培育天然无PERV猪群存在很广西大学硕士学位论文我国小型猪内源性反转录病毒的检测与五指山毒株全长eDNA克隆的构建大困难，且分离PERV困难。因此，研究者们试图借助反向遗传学技术来研究PERV分子生物学特性，以便找出消除PERV感染的方法。反向遗传学技术为RNA病毒

4、分子生物学研究开辟了新途径，它是通过构建病毒的全长cDNA克隆，体外转录出病毒RNA后转染易感细胞来拯救RNA病毒的技术。由于最终获得的RNA病毒来源于cDNA，这样就可以通过对cDNA的操作来实现对RNA病毒基因组的分子生物学操作。其核心技术包括：病毒基因组全长cDNA克隆技术及感染性转录体制备技术。其中，病毒基因组全长cDNA克隆是重要的第一步。目前，国外已构建成功的PERV全长cDNA克隆有10株，多数是通过建库的方法构建的。该方法繁琐费时。本研究通过对RT—POR反应液组成和热循环条件的优化，建立了PERV-WZS株基因组全长cDNA分段扩增的RT—PCR方法。在完成P

5、ERV全长序列测定的基础上，利用体外基因重组的传统方法构建出病毒的全长cDNA克隆，为进一步构建PERV—WZS株感染性cDNA克隆，深入研究PERV感染与整合机制奠定了基础。为鉴定全长cDNA克隆中病毒序列的完整性，重新设计了新引物，以构建的pWSK—WZS—PERV质粒为模板，分别扩增基本覆盖PERV—WZS株基因组全长的cDNA片段，大小在500—3500bp之间，结果表明PERV—WZS株全长cDNA克隆是完整的。为进一步验证所构建的全长cDNA克隆中各编码基因是否有缺失、插入，又随机挑取几个片段进行测序，测序的结果与原序列基本一致；为检测设计的外源序列是否完整的加入全

6、长cDNA克隆中，又进行了全长cDNA克隆首尾两端的测序，结果显示所设计的外源序列均完整的插入PERV—WZS株全长cDNA克隆中。由此说明，本研究所构建的PERV—WZS株全广西大学硕士学位论丈我国小型猪内源性反转录病毒的检测与五指山毒株全长cDNA克隆的构建长cDNA克隆是正确的。本研究将为进一步构建PERV—WZS株感染性cDNA克隆，深入研究PERV感染与整合机制奠定了基础。关键词：猪内源性反转录病毒检测全长eDNA扩增克隆lII!里查茎婴主兰竺箜圭—』望型兰塑壁塑塑!垦堡垂垄圭箜堡型皇墨塑坐圭竖全苎!!坠圭堕箜塑垄DETEcTIoNOFPORCINEENDOGENOU

7、SRETROVIRUSINCHINEsEMlNIPIGSANDCONSTRUCTIONOFTHEFULL．LENGTHcDNAOFwzsMINIPIGPORCINEENDOGENOUSRETROVIRUSGENOMEABSTRACTPo‘。ineendogenousretroVims(PERV)isamemberofMammalianTypeCRetroviridae，integratingintothegenomeofporcinesbythefonllofDrevimsDNAandrep