应用shrna敲减ilk对胶质瘤细胞系u251增殖、迁移、侵袭、肿瘤形成影响

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1、密级：学校代码：10075分类号：学号：20121769医学硕士学位论文应用shRNA敲减ILK对胶质瘤细胞系U251增殖、迁移、侵袭、肿瘤形成影响学位申请人：王光翌指导教师：李春晖学位类别：医学硕士学科专业：外科学授予单位：河北大学答辩日期：二○一五年六月ClassifiedIndex:CODE:10075U.D.C:NO:20121769ADissertationfortheDegreeofM.MedicineTheeffectofknockdownILKbyshRNAontheproliferation,migrationandinvasionofhumangliomacellU

2、251Candidate:WangguangyiSupervisor:LichunhuiAcademicDegreeAppliedfor:MasterofMedicineSpecialty:SurgeryUniversity:HebeiUniversityDateofOralExamination:June,2015摘要摘要目的：探讨应用shRNA敲减ILK后对人脑胶质瘤细胞U251增殖、迁移、侵袭及体外肿瘤形成的影响实验方法：1）应用shRNA发转染人脑胶质瘤细胞U251系后获得稳定转染细胞株；为了明确已经从转录及翻译水平均稳定敲减ILK表达水平，实验采用RT-PCR、Western

3、blot分别测定转染前后U251人脑胶质瘤细胞中ILK的mRNA以及其蛋白表达情况；2）shRNA-ILK对细胞增殖能力影响⑴应用CCK-8法检测定shRNA转染后细胞吸光度值改变，进而了解敲减ILK后对增殖速度的改变；⑵流式细胞术（FCM）检测转染前后细胞增殖周期变化；⑶免疫荧光法检测Ki67的表达水平；为了明确细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的转录及其蛋白表达水平，实验采用RT-PCR、Westernblot分别检测。3）shRNA-ILK对细胞迁移能力及侵袭能力影响⑴Transwell小室检测敲减ILK表达后，U251细胞迁移、侵袭能力的改变；⑵免疫荧光法检测E-cadher

4、in的表达；RT-PCR、Westernblot分别检测E-cadherin、Snail转录及其蛋白表达情况；4）人脑胶质瘤U251裸鼠移植瘤模型建立和观测。实验结果：⑴稳定转染的U251细胞ILK蛋白和mRNA表达水平明显下降；⑵敲减ILK表达的U251细胞株增殖、迁移及侵袭能力降低；与增殖（Ki67、CyclinD1）、迁移及侵袭（E-cadherin、Snail）相关的指标有明显变化，这些指标表达水平与对照组比较均有显著性差异（P<0.05）；⑶应用shRNA敲减ILK表达细胞株裸鼠成瘤能力明显降低。结论：应用shRNA敲减ILK表达的U251胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及成瘤能

5、力均显著降低，因此ILK可能是抑制胶质瘤的重要基因。I关键词ILKshRNA胶质瘤增殖迁移侵袭AbstractAbstractObjective:Toinvestigatethechangeofproliferation,migration,invasionandtumorigenesisofhumanbraingliomacellsU251afterknockdownILKbyshRNAinterference.Methods:1)U251weretransfectedwiththespecificshRNAvectorandstabletranfectedcellswereesta

6、blished.Western-blot，RT-PCRareseparatelyperformedtodetecttheexpressionofILKmRNA,ILKinU251celllineandinstabletranfectedcellsstrainsamplesrespectively.ILKexpressionwassignificantlyreduced.2)theeffectofshRNA-ILKoncellproliferativecapacity;(1)CCK-8isusedtodetectChangesincellproliferationrateaftertra

7、nsfection.(2)Flowcytometryisusedtodetectthechangeofcellcyclebeforeandaftertransfection(3)ImmunofluorescenceisusedtodetecttheexpressionofKi67.Western-blot，RT-PCRareseparatelyperformedtodetecttheexpressionofCyclinD1,CyclinD1mR