细菌检验中菌种的保存及保管

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1、细菌检验中菌种的保存及保管(哈尔滨市南岗区疾病预防控制中心微牛物检验科黑龙江哈尔滨150001)【摘要】大多数细菌都可用人工方法培养，握细菌培养的基木技术，如无菌技术、各种细菌的营养要求和适宜的培养方法及保存、保管等。菌种的保存，特别是标准菌株的保存是细菌学检验，教学科研机构及有关牛产单位的重要工作之一。在保存菌种的过程中，除了必须保证菌株的存活外，还应要求在保存过程中，保持其固有的各种牛物学性状及抗原特性等。【关键词】细菌检验；细菌培养；保存及保管【中图分类号】R37【文献标识码】A【文章编号】1007-8231(2016)13-021

2、9-02细菌培养是感染性疾病病原学诊断的重要环节，并有利于细菌感染的治疗和预防。也是医院感染和流行病学调查的手段。菌种的保存，特别是标准菌株的保存是细菌学检验，教学科研机构及有关牛产单位的重要工作之一。细菌实验室，一般应保存一套按规定允许保存的标准菌种和菌株，保存的种类视工作需要而定。1.菌种的保存为此必须注意以下问题：①控制传代次数：菌种传代次数越多，其突变的几率也就会越高。②用典型菌落传代：为防止盲目传代，每次传种，均应做划线分离，选出具有典型性状的菌落进行传代，用于保存。③通过易感动物恢复固有特性：对于已变异的病原菌，可采用接种易感

3、动物的方式，将具有毒力的细菌重新选择出来，同时还可使一些表型变异的细菌恢复原有特性。菌种的保存方法有以下几种方法：1.1固体培养基保存法此为最简单的保存方法，但最大的不足是较易发牛变异。为了延长菌种的保存时间，接种斜面时，仅由斜面底部划一直线即可。①普通琼脂斜面保存法：适合于对营养要求不高细菌的保存。接种后，35°C18〜24h培养后，移于4°C的冰箱中，可保存一个月，每月传代一次。为防于涸，在斜面底部可放少许无糖肉汤（但变形杆菌“0X”及伤寒沙门菌除外）。②血琼脂斜面保存法：适合于保存对营养要求高的细菌，链球菌应半个月传代一次，肺炎链球

4、菌等新分离的菌株应2〜4d传代一次。③鸡蛋斜面保存法：适合保存Vi抗原的沙门菌属细菌及含表面抗原的细菌，一般可保存一个月［1］。1.2半固体穿刺保存法适合于肠道杆菌及葡萄球菌等一般细菌的保存。当细菌生长良好后，在其表面加一层lcm高无菌的液体石蜡，在4°C冰箱中，一般细菌可保存数月。凡需特殊培养的细菌，则分别选用各自适宜的培养基进行保存。1.3干燥保存法干燥保存法是将细菌体内的水分蒸发掉，使细菌处于代谢停滞的状态，从而达到长期保存的目的。干燥保存法有多种，如砂土干燥保存法，明胶保存等，其中最好的方法是冷冻真空干燥保存法，此法是将生长旺盛的

5、细菌在冻结状态下真空干燥，使细菌保持休眠状态［2］。该法可免去细菌的频繁传代，也可防止在传代过程中可能造成的污染、变异或死亡。保存期一般在3〜5年，有的可达10年以上，是目前最有效的保存方法。①准备安甑管：选用中性硬质玻璃安甑管，用10%HCI浸泡8〜10h,再用自来水冲洗多次，最后用蒸徭水洗1〜2次，烘干。管口塞上棉花，121°C灭菌30mino管壁贴印有菌种名称及接种日期的标签，并用固体石蜡熔化后薄薄地封一层，以防标签字模糊。②制备脱脂牛奶：将新鲜牛奶煮沸，除去表面油脂，用脱脂棉过滤，离心3000r/min15min,再除去上层油脂,

6、分装，115°C灭菌30min,并作无菌试验。③制备菌液：吸取3ml无菌牛奶加入已培养16〜18h的斜面菌种管，用接种环轻轻搅动菌苔，搓动试管，制成均匀的细胞悬液。④分装菌液：用无菌的长颈滴管将菌液分装于安咅瓦管底部，每管装0.2ml。①预冻：将装有菌液的安甑置一40°C低温冰箱酒精槽内快速冷冻。安甑快速冷冻只需4〜5min,然后将安甑放于干燥器内，置・20°C低温冰箱或装有维持冷冻剂⑴3的盐冰混合剂）的槽内，可保持6〜18h。②真空干燥：预冻完成后，开动真空泵抽气。使气压降至133.3kPa以下，维持冻结剂可于4h后移去。继续于室温中抽

7、气，直至变色硅胶由粉红色变为全蓝色，再继续抽气，达到完全干燥。一般菌种干燥需6〜8h。③封管：待菌种完全干燥后，立即从干燥缸内取出安甑，置于抽气管上抽成真空，约需3〜lOmino用高频真空检测仪检查，若安甑颈部呈现淡紫色荧光，即可边抽气边封口。置4°C冰箱保存。无干燥机的实验室，可自行安装简易冷冻干燥系统。安装吋，所有的连接处必须严缝，所用管道以粗为好，并尽量缩短真空系统线路，以便通畅，安装完毕，应检查有无漏气，以其压力能低到0.2mmHg为准。④复苏培养：安甑先用碘酒、酒精消毒，置火焰上烤热，滴加无菌蒸憾水,使安甑尖端炸裂。然后用数层纱

8、布包住折断。用无菌吸管取0.2ml肉汤注入安甑，使其全部溶解，移种适宜培养基。1.4液氮超低温保存将菌种保存在J50〜-196%超低温的液氮中，在该温度下，细菌等微生物的代谢处于停滞状态，因此