内源性大麻素2-ag对lps诱导的尾核神经元损伤的保护作用及其机制研究

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1、分类号R96密级公开UDC硕士学位论文内源性大麻素2-AG对LPS诱导的尾核神经元损伤的保护作用及其机制研究学位申请人：彭芳学科专业：药理学指导教师：杨红卫教授二○一三年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineProtectiveEffectofEndocannabinoid2-AGAgainstLPSInducedNeurotoxicityinPrimaryCulturedNeuronsfromRatCaudateNucleusanditsMe

2、chanismGraduateStudent:PengFangMajor:PharmacologySupervisor:Prof.YangHongweiChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2013三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论

3、文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：建立一种大鼠尾核神经元的原代培养方法，并对其进行形态学观察和免疫

4、组织化学鉴定，初步探索内源性大麻素2-AG对脂多糖（LPS）所诱导的尾核神经元Na、K通道特性变化的影响。探讨内源性大麻素2-AG介导LPS诱导的尾核神经元损害的保护作用的机制及其相关的信号转导通路。方法：(1)自新生24小时内的wistar大鼠新生鼠大脑中分离出尾核，结合酶消化及机械吹打分离尾核神经元，进行体外原代神经元培养。(2)采用神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学法对神经元进行鉴定，应用酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学法对多巴胺（DA）能神经元进行鉴定。(3)用全细胞膜片钳技术记录电压门控钠通道电流和电压门控钾通道（Kv）电流。(4)采用Hochest染色观察2-AG对

5、LPS所诱导的尾核神经元神经毒效应的影响。(5)Caspase3活性检测试剂盒检测2-AG对LPS诱导的尾核神经元Caspase-3活性的影响。(6)用westernblot测定ErkⅠ/Ⅱ、phosph-ErkⅠ/Ⅱ、p38MAPK、phosph-p38MAPK、NF-κB、p-NF-κB、COX-2的蛋白含量。结果：(1)从新生鼠分离的尾核神经元在本实验条件下生长良好。原代培养7~11天的尾核神经细胞在形态上趋向成熟。(2)NSE免疫组织化学染色和TH免疫组织化学染色结果显示所培养细胞90%以上为多巴胺能神经元细胞。(3)分离出的神经元形态正常，细胞膜光滑有弹性，保存了主要离子通道

6、的活性。LPS处理后钠通道激活曲线明显左移，激活阈值降低；LPS同时加2-AG处理后，该现象消失。但LPS对钠电流的失活没有影响(4)LPS处理12小时后，尾核神经元表现出典型的凋亡特征，LPS同时加入2-AG，核固缩细胞的数目明显减少。(5)经过LPS处理后尾核细胞的Caspase-3活性显著增强，2-AG可部分抑制LPS诱导的这种Caspase-3活性的增强，CB1受体的拮抗剂SR1可取消2-AG的这种效应。(6)内源性大麻素2-AG可抑制COX-2、phosph-ErkⅠ/Ⅱ、p-NF-κB、phosph-p38MAPK的表达，该作用至少部分由CB1受体介导。结论：成功建立体外原

7、代培养尾核神经元模型，细胞饱满，细胞膜光滑有弹性。2-AG可以抵抗LPS诱导的尾核神经元损伤。2-AG对LPS诱导的尾核神经元的损害的保护作用可能是通过抑制COX-2的表达来实现的，且CB1受体介导了这一效应。而该保护作用可能与MAPK/NF-κB信号传导通路的抑制有关。该研究对理解神经退行性疾病提供理论基础及新的治疗途径和方法。关键词：尾核神经元COX-2MAPK/NF-κB信号传导通路2-AG膜片钳II三峡大学硕士学位论文AbstractO