mirna-646在脂多糖处理后的a549细胞中的表达及功能分析

《mirna-646在脂多糖处理后的a549细胞中的表达及功能分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、南方医科大学2010级硕士学位论文MiRNA一646在脂多糖处理后的A549细胞中的表达及功能分析TheExpressionofMicroRNA一646inA549cellTreatedbyLipopolySaccharideandItsFunctionAnalysis课题来源：自选课题学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院程东良王斌副教授儿科学学术型硕士研究生第二临床学院2013年4月26日广州I㈣删鬯硕士学位论文一一一一一MiRNA．646在脂多糖处理后的A549细胞中的表达及功能分析硕士研究生：程东良指导教

2、师：王斌副教授摘要研究背景急性呼吸窘迫综合征(Acuterespirator’ydistresssyndrome，ARDS)是指脓毒症、重症肺炎、多发伤等肺内外疾病侵袭机体后出现的炎性因子大量释放，肺泡上皮细胞损伤及肺表面活性物质合成减少为主要表现的临床综合征。其临床特征包括呼吸频速和呼吸窘迫，进行性低氧血症，X线呈现弥漫性肺浸润影。虽然治疗手段在不断增加，但ARDS现在仍是PICU中威胁人类生命的重要原因之一。据统计，美国每年有19力．的ARDS病人，死亡率高达39．4％；而我国的死亡率更高，达到71．4％。现阶段ARDS

3、的发病机制尚未完全明了，但是在ARDS时肺表面活性物质合成是减少的。Schmidt等发现在ARDS患者的肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A(surfactantassociatedproteinA，SP-A)、肺表面活性蛋白B(surfactantassociatedproteinB，SP—B)、肺表面活性蛋白C(surfactantassociatedproteinC，SP-C)、二棕榈酰卵磷脂明显减少，随着ARDS的好转，它们的量相应的增加。在严重的ARDS病人给予SP～C后，能够明显的减轻缺氧，减少死亡率。microRNA(

4、miRNA)广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA。近年来研究发现miRNA具有广泛的基因调节功能，它能对细胞的生长、分化、凋亡及关键蛋白的分泌等各个层面进行调节。多种miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中，这个环境控制着成千上力．的编码基因的mRNA，使得各种蛋白的表达处在一个合适的水平，调控各种关键蛋白T摘要质的表达。现阶段人们越来越重视miRNA和肺部疾病的关系的研究，人们已经对miRNA和肺的生长发育、肺纤维化、肺部肿瘤、肺部炎症等方面进行了研究，并且证实了miRNA参与

5、了上述的生命活动。ARDS的发病机制仍未完全明了，缺乏有效的治疗手段，miRNA在ARDS发生发展过程中的作用越来越引起人们的重视。miRNA机制的研究可能是基因、蛋白水平有关ARDS／ALI发病机制及治疗研究的重要补充。目前对ARDS发病机制方面的报道很少涉及miRNA，ARDS时在miRNA水平有什么变化?我们通过miRNA芯片检测损伤前和损伤后的A549细胞，发现大量差异表达的miRNA。我们进一步对差异表达的miRNA进行靶基因的预测，发现miRNA的靶基因和肺表面活性相关蛋白、肺的生长发育、炎症、细胞凋亡、肿瘤等方

6、面相关。我们选择了和肺表面活性相关蛋白相关的miRNA一646(miR-646)进行下面的实验，进一步探讨miR一646在实验中的变化，预测miR一646的靶基因，进一步完善ARDS的发病机制，为ARDS的治疗提供新的靶点。目的1．检测A549细胞通过脂多糖(Lipop01ysaccharide，LPS)处理前后SP—A、SP-C表达量的变化。2．通过微阵列芯片技术测定LPS处理A549细胞前后miRNA的差异表达谱，确定进行下面实验的差异表达的目标miRNA和目标靶基因。3．探讨miRNA参与ARDS发生发展过程中可能的机

7、制，为ARDS的诊治寻找新的靶点。方法1．实验分为实验组及对照组，对照组是以RPMI一1640培养液处理A549细胞24小时；实验组分别以5ug／mt、10ug／ml、15ug／ml的LPS处理A549细胞24小时。通过免疫细胞化学染色、westernblot法检测各组细胞中的SP—A、SP—C的表达量。并用RT—PCR方法检测各组细胞中SP—A、SP—C的mRNA的表达量。T1硕士学位论文2．利用miRNA基因芯片检测10pg／ml的LPS处理前后A549细胞，找出其中差异表达大的miRNA。利用生物信息学软件(Targe

8、tScan，miranda，C1ip—seq，miRDB)预测差异表达大的miRNA的靶基因，找到一个靶基因蛋白在ARDS发生、发展过程中起重要作用的目标靶基因，确定目标miRNA和目标靶基因。并用实时荧光定量PCR的方法检测各组细胞中目标miRNA的表达量，验证基因芯片的准确性。并做目标