伤寒沙门菌质粒对dc成熟及其自噬过程和免疫功能的影响

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1、伤寒沙门菌质粒对DC成熟及其自噬过程和免疫功能的影响中文摘要SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文伤寒沙门菌质粒对DC成熟及其自噬过程和免疫功能论文题目的影响研究生姓名韦莉指导教师姓名黄瑞专业名称病原生物学研究方向抗感染免疫论文提交日期2013年3月1伤寒沙门菌质粒对DC成熟及其自噬过程和免疫功能的影响中文摘要中文摘要伤寒（typhiodfever）又称为肠热病（entericfever），是一种古老的由伤寒沙门菌（Salmonellatyphi，S.typhi）引起的急性肠道传染病。20世纪80年代末至90年代初，我国十三

2、省市曾发生大规模多重耐药伤寒沙门菌的暴发流行。对591例伤寒沙门菌临床分离株进行药敏、质粒电泳、接合转移、转化及消除试验后发现，6流行期间分离的多重耐药菌株均含一分子量98.6×10道尔顿（98.6Md，约159Kb）的耐药质粒，可编码对多种药物的抗性，属不相容性C群（IncC），称之为pRST98。该质粒具有多效性，除编码抗药性外还能增强宿主菌的毒力，是一种既能介导细菌耐药性又能增强细菌毒力的具有双重功能的“嵌合型”质粒。伤寒沙门菌是兼性胞内致病菌，具有靶向感染专职抗原提呈细胞（antigenpresentingcell，APC）

3、的特点，侵入机体后可定居在树突状细胞（dendriticcell，DC）内生长繁殖。DC是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，在抗沙门菌感染免疫反应中起着关键作用，任何对DC功能的干扰都可能影响感染结局。本研究通过建立沙门菌感染的细胞模型和实验动物模型，研究伤寒沙门菌质粒pRST98对DC成熟及其自噬过程和免疫功能的影响，揭示其增强宿主菌毒力的发生机理，为下一步继续深入研究质粒的毒力机制提供实验和理论依据。第一部分伤寒沙门菌质粒对DC成熟和自噬过程影响的体外实验以携带pRST98的野生株S.typhi-WT、消除pRST98的伤寒沙门菌

4、突变株S.typhi-Δ-pRST98以及pRST98经接合转移重新导入S.typhi-Δ-pRST98所获得的回补株S.typhi-c-pRST98为研究对象，将细菌与小鼠骨髓来源的DC（bonemarrow-derivedDC，BMDC）共培养建立体外感染模型。分别在感染的不同时间段（2h、4h、12h和24h）收获细胞，采用以下方法进行实验检测：①流式细胞术（flowcytometry，FCM）检测DC表面共刺激分子CD40、CD和CD86的表达以及DC的吞噬能力；②酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunos

5、orbentassay，ELISA）检测细胞Th1型细胞因子γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）及Th2型细胞因子IL-10的表达；③WesternBlot（WB）检测细胞自噬标志蛋白I中文摘要伤寒沙门菌质粒对DC成熟及其自噬过程和免疫功能的影响——微管相关蛋白1轻链3-II（Microtubule-associatedprotein1lightchain3-II，MAP1-LC3-II，即LC3-II）和Beclin-1的表达；④透射电镜（transmis

6、sionelectronmicroscope，TEM）观察细胞内自噬小体。实验结果表明，①S.typhi-WT感染组DC表面CD40、CD和CD86的表达量均显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P<0.05，P<0.01，P<0.01）；S.typhi-c-pRST98感染组与S.typhi-Δ-pRST98感染组比较，CD和CD86的表达量均显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P均<0.05）；S.typhi-WT感染组和S.typhi-c-pRST98感染组DC的吞噬率均显著高于S.typhi-Δ

7、-pRST98感染组（P均<0.05）；②S.typhi-WT感染组DC的IFN-和IL-12的分泌量均显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P均<0.01），而IL-10分泌量显著高于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P<0.05），S.typhi-c-pRST98感染后，除了IL-10的分泌量与S.typhi-Δ-pRST98感染组无显著差异外（P>0.05），IFN和IL-12分泌量显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P<0.01，P<0.05）；③S.typhi-Δ-pRST98感染细胞Be

8、clin-1的表达量显著高于S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染组，同时S.typhi-Δ-pRST98感染细胞LC3-II表达增强，而S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染组LC3-II仅有