沙门菌质粒毒力基因spvb突变株的构建及其对上皮细胞自噬的影响

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1、苏州大学硕士学位论文沙门菌质粒毒力基因spvB突变株的构建及其对上皮细胞自噬的影响姓名：邱桥成申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：黄瑞2012-10沙门菌质粒毒力基因印诏突变株的构建及其对上皮细胞自噬的影响中文摘要中又丰葡芰目的：构建沙门菌质粒毒力基[](SalmonellaplasmidvirulencegeneB，spv曰)突变株，通过上皮细胞感染模型，研究该基因对细胞自噬的影响，为探讨沙门菌质粒毒力基因spvB致病机制及减毒活疫苗的制备提供理论和实验依据，并为后续利用小鼠感染模型进一步研究该基因的功能提供工具和手段。方法：～．沙门菌质粒毒力基因spvB突变株

2、的构建1．根据GeneBank序列数据库中沙门菌质粒毒力基因spvB序列，用PrimerPremier5．0设计PCR特异性引物，以鼠伤寒沙门菌标准株SR．11基因组为模板，扩增获得spvB基因缺陷性核苷酸片段后连接至自杀质粒PGMBl51。将改建的自杀载体导入含有spvB基因的鼠伤寒沙门菌SR一11野生株中进行同源重组，用PCR方法挑选稳定传代的突变株并进行基因测序鉴定。2．根据spvB基因序列设计引物，以鼠伤寒沙门菌标准株SR．11基因组为模板，通过PCR扩增获得含spvB基因编码区域的全长DNA，并与表达载体pBAD／glII定向连接，转化至大肠杆菌TOPIO中

3、筛选阳性克隆质粒，经序列分析后将阳性重组载体电转化至spvB基因突变株，作为spvB基因突变回补株，用PCR、核酸测序及蛋白免疫印迹(Westemblot，WB)鉴定。二．沙门菌质粒毒力基因spvB对上皮细胞自噬的影响1．以携带spvB的鼠伤寒沙门菌标准株SR．11，敲除spvB的鼠伤寒沙门菌突变株(SR．1l-AspvB)及其回补株(SR一11-c．印佃)，与稳定转染了带有红色和绿色荧光蛋白标记微管相关蛋白1轻链3(microtubule．associatedprotein1lightchain3，LC31(mRFP—GFP．LC3)的HeLa细胞体外共培养，制作细

4、胞感染模型。将对数生长期细菌按感染复数(multiplicityofinfection，MOI)100：1感染细胞，在细菌和细胞共培养1h后吸除上清，此时定为⋯0’点。随后加入含100I．tg／ml阿米卡星(Amikacin，AMK)培养基作用2h以杀灭胞外菌，最后将AMK浓度降至10}tg／ml以抑制从感染细胞中释放至培养基中的细菌生长。分别在共培养后lh、3h和5h收集细胞，中文摘要沙门菌质粒毒力基因spvB突变株的构建及其对上皮细胞自噬的影响用共聚焦激光扫描显微镜(Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)观察胞内LC3．II黄色

5、点状结构。2．以携带spvB的鼠伤寒沙门菌标准株sR．11，敲除spvB的鼠伤寒沙门菌突变株(SR一11-AspvB)及其回补株(SR．11-c．spvB)与HeLa细胞体外共培养，制作细胞感染模型。以对数生长期细菌按感染复数(multiplicityofinfection，MOI)100：1感染细胞，在细菌和细胞共培养1h后吸除上清，此时定为“0”点，随后加入含100I．tg／ml阿米卡星(Amikacin，AMK)培养基作用2h以杀灭胞外菌，最后将AMK浓度降至10rtg／ml以抑制从感染细胞中释放至培养基中的细菌生长。分别在共培养后1h、3h和5h收集细胞，用蛋

6、白免疫印迹法(Westemblot，WB)检测白噬相关蛋白Beclin．1和p62蛋白的表达情况，并用平板菌落计数法检测胞内集落形成单位(colonyformingunit，CFU)。结果：’一．沙门菌质粒毒力基因spvB突变株的构建1．经PCR和基因测序证实，成功获得了spvB基因缺陷的鼠伤寒沙门菌突变株SR-11-AspvB。2．经PCR、基因测序和WB证实，成功获得了spvB基因突变回补株SR一11-c-．驴佃。二．沙门菌质粒毒力基因spvB对上皮细胞白噬的影响1．CLSM检测自噬相关蛋白LC3一II结果显示，细菌和细胞共培养1h后，SR．11和回补株SR．11

7、．c．spvB感染组细胞内LC3一II的黄色荧光点状聚集数明显低于SR一11MspvB感染组(氏O．05)；3h和5h时三组黄色荧光点状聚集数未见明显差异(胗O．05)。在细菌和细胞共培养的各时间点，SR一11和回补株SR．11．c．spvB感染组细胞内LC3一II的黄色荧光点状聚集数无明显差异(胗0．05)。2．WB检测结果显示，在细菌和细胞共培养1h后，SR一11和SR一11一C—spvB感染组细胞白噬相关蛋白Beclin一1表达低于SR一11-AspvB感染组(尺0．05)，3h和5h无明显变化(胗O．05)。在细菌和细胞共培养1h后，SR一1