伤寒沙门菌质粒对细菌生物膜形成的影响及分子机制研究

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1、苏州大学硕士学位论文伤寒沙门菌质粒对细菌生物膜形成的影响及分子机制研究姓名：廖莉申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：黄瑞2012-11伤寒沙门菌质粒对细菌生物膜形成的影响及分子机制研究中文摘要目的：中文提要研究伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphi，&typhi)质粒pRsT98与细菌生物膜(biofilm，BF)形成的关系，探讨其与细菌密度感知系统(quorum．sensing，QS)相互作用的分子机制，为后续防治沙门菌感染及新药靶位的发现提供理论和实验依据。方法：1．伤寒沙门菌质粒对生物膜形成的影响(1)生物膜形成适宜温度

2、和时间的确定用携带pRsT98的伤寒沙门菌野生株ST8于30。C和37。C培养3d，用半定量法确定BF形成的最适温度。将稀释的菌液于30。C分别培养12h、1d、2d、3d、4d和5d，用半定量法确定BF成熟的时间。(2)伤寒沙门菌不同菌株生物膜形成的比较分别用携带pRsr98的伤寒沙门菌野生株ST8、消除pRsv98的突变株ST8-ApRsT98和将pRsT98经接合转移重新导入ST8-ApRsT98所获得的回补株ST8．C．pRsv98，按上述实验结果确定的条件建立BF模型。分别用结晶紫染色法、半定量法、扫描电镜(scanningelectronmicroscop

3、y,SEM)观察和共聚焦激光显微镜(confocallaserscanningmicroscopy,CLSM)断层扫描比较受试菌形成BF的差异。(3)伤寒沙门菌不同菌株对HeLa细胞粘附的比较将实验菌株ST8、STs-ApRsT98和ST8-C—pRs”8按感染复数(multiplicityofinfection，MOI)100：1与HeLa细胞共培养1h后，收集细胞用PBS洗涤破膜后平板菌落计数法检测集落形成单位(colony-formingunit，CFU)比较受试菌对细胞的粘附力。2．伤寒沙门菌质粒与细菌密度感知系统相互作用的分子机制将实验菌株ST8、STs-A

4、pRsa-98和STs-c-pRsT98分为两组：一组加入1lxM／mL的QS系统信号分子酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserinelactones，AHLs)商品化中文摘要伤寒沙门菌质粒对细菌生物膜形成的影响及分子机制研究药物辛酰基高丝氨酸内酯(N-octanoyl—L—homoserinelactone，C8．AHLs)；另一组加入等量的生理盐水(normalsaline，NS)作为对照，分别进行下述实验。(1)AHLs对受试菌粘附的影响将受试菌按感染复数(multiplicityofinfection，MOI)100：1与HeLa细胞共培养，1h后收集细

5、胞用PBS洗涤破膜后用平板菌落计数法检测CFU比较受试菌对细胞的粘附力。(2)AHLs对受试菌抗血清杀菌能力的影响将受试菌液浓度调整至104CFU／ml，分别与兔和豚鼠血清37。C共作用2h后，用平板菌落计数法检测CFU比较受试菌的存活数。(3)AHLs对受试菌rck基因转录水平的影响将两组细菌37℃静置培养1h，药物和细菌充分作用后分别提取细菌的总RNA，进行逆转录聚合酶链反应(reversetranscription·PolymeraseChainReaction，RT-PCR)，检测AHLs对补体杀菌抗性基因(resistancetocomplementkill

6、inggenes，rck)mRNA转录水平的影响。结果：1．沙门菌质粒对生物膜形成的影响(1)生物膜形成适宜温度和时间的确定：菌株ST830。C培养比37。C形成BF能力强。30℃培养3d后BF生长趋于稳定，故选择30。C培养3d作为测定BF形成的条件。(2)伤寒沙门菌不同菌株生物膜形成的比较：结晶紫染色、SEM及CLSM观察显示，伤寒沙门菌中野生株ST8和回补株ST8．C—pRsT98均形成BF，而消除pRsT9S的伤寒沙门菌ST8-ApRsT98未见明显BF形成。半定量法测定显示，ST8和ST8一C．pRsT98的019570值均大于STs-ApRsT98，差异有

7、统计学意义(P<0．05)，STs与ST8．C—pRsT98的OD570值无统计学差异(扮0．05)。(3)伤寒沙门菌不同菌株对HeLa细胞的粘附比较：STs、STs-ApRsT9s和ST8一C．pRsq'98对HeLa细胞的粘附率未见明显差异(尸>O．05)。2．伤寒沙门菌质粒与密度感知系统相互作用的分子机制(1)AHLs对受试菌粘附的影响：AHLs干预组STs及STs—c-pRsrgs对HeLa细II伤寒沙门菌质粒对细菌生物膜形成的影响及分子机制研究中文摘要胞的粘附率均高于ST8-ApRsT98，差异有统计学意义(P<0．05)，sT8及ST8一