苦豆碱抗结肠癌细胞株sw620作用机制的实验研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文苦豆碱抗结肠癌细胞株SW620作用机制的实验研究Studyontheanti-colorectalcarcmomamechanismsofAloperine课题来源：自选课题学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院郑堰心邓虹珠教授中药学学术型硕士研究生中医药学院答辩委员会主席于荣敏教授答辩委员会委员翁建林教授张继平教授崔燎教授莫志贤教授2014年3月20日广州硕士学位论文苦豆碱抗结肠癌细胞株SW620作用机制的实验研究硕士研究生：郑堰心指导老师：邓虹珠教授摘要结直肠癌(CRC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。居世界恶性

2、肿瘤发病和致死的第三、四位，发病率约为7／100000，每年大约有5000新发病例和3200死亡病例。因此。CRC是每年肿瘤发病率和死亡率的主要原因。目前，手术和术后结直肠癌的化疗仍是治疗CRC的一种有效方法。但它的副反应导致生活质量严重下降。中药及其有效成分预防和治疗肿瘤的作用与化学药物相比有很多优势。近年来世界对中药的接受度逐渐提高，利用现代化手段提取中药中有独特生物活性的物质，对我国药物研发和医药产业的可持续发展具有十分重要的意义。中药及其有效成分的抗肿瘤作用研究在世界范围内已成为热点研究课题。研究发现中药抗肿瘤的作用机制主要有以下几个方面(1)影响肿瘤细

3、胞增殖动力学和细胞周期(2)诱导肿瘤细胞凋亡(3)调控基因表达及抗诱变作用(4)抑瘤及抗转移(5)免疫调节。因此，寻找高效、低毒防治结直肠癌复发和转移的药物是目前CRC治疗中迫切需要解决的问题。中药苦豆子(SophoraAlopecuraides,三．)为豆科(Leguminosae)槐属多年生草本植物。广泛分布于我国西北华北荒漠地区，性味苦寒，具有清热燥湿、止痛杀虫等作用。现代药理研究表明其具有抗炎、提高免疫力、中枢神经镇静等作用。目前发现，苦豆子中含有丰富的喹诺里西丁(Quinlizidine)类生物碱，此类生物碱均为含氮的有机碱化合物，具有明显的抗癌作用，

4、是近年抗肿瘤药摘要物研究重点之一，其中苦参类生物碱如苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱等之前已有抗肿瘤的多种报道。本课题组在研究中发现，苦豆子总生物碱对溃疡性结肠炎具有良好治疗作用，苦豆碱对结直肠癌亦有较好抑制作用。由于溃疡性结肠炎与CRC具有显著相关性，因此本课题拟对苦豆子中的苦豆碱(ALO)进行抗结直肠癌的研究，观察其体外作用及作用机制。苦豆子中主要化学成分包括生物碱、黄酮类、有机酸、氨基酸、蛋白质和多糖类等，其它还有脂肪酸及无机元素等。目前用于药物开发的生物碱主要有8种：苦参碱(matrine，MT)，氧化苦参碱(oxymatrinel，OMT)，槐果碱(

5、sophocarpine，SO)，氧化槐果碱(oxysophocarpine，OSC)，槐胺碱(sophoramine，SA)，槐定碱(sophoridine，SRI)，莱曼碱(1ehmarmine，LEH)，苦豆碱(aloperine，ALO)。目的本课题通过六种不同的生物碱对结肠癌细胞株SW620的抑制作用，初步筛选出对SW620抑制率最强的生物碱，针对生物碱作用的特点，结合分子生物学理论探讨其抗结肠癌的作用机制。方法1．苦豆子生物碱对结肠癌细胞株抑制作用的初步筛选。采用MTT法检测苦豆碱，槐定碱，苦参碱，野靛碱，氧化苦参碱，槐果碱对结肠癌细胞株SW620的

6、抑制作用，以及苦豆碱对结肠癌细胞株SW620、DLDl、HCTll6、HT29和174t的抑制作用。2．ALO对结肠肠癌SW620细胞周期的影响。流式细胞术检测ALO对SW620细胞周期的改变，免疫印迹法检测细胞周期调控蛋白p16，CDK4，cyclinDl，Rb，phosphor-Rb(Ser780)的水平，实时荧光定量PCR检测其mRNA水平。3．ALO对结肠癌细胞SW620凋亡作用的影响。采用HE染色法，Hoechst33258及PI染色法观察细胞形态学的改变。流式细胞术检测苦豆碱作用SW620后细胞凋亡的变化及细胞线粒体膜电位的影响。免疫印迹法检测细胞凋

7、亡调控蛋白Bcl．2，Bax，caspaSe3，caspaSe9，PARP蛋白的水平，实时荧光定量II硕士学位论文PCR检测bcl．2及BaxmRNA水平的变化。4．ALO作用SW620后，Akt通路的影响。采用免疫印迹法检测Akt及p-Akt(Ser473)，p-Akt(Thr308)水平的变化。结果1．MTT法检测ALO对结肠癌SW620细胞生长的影响：与其他五种生物碱比较，ALO对SW620细胞株有明显增殖抑制作用；SW620细胞生长增殖抑制率随着时间和浓度的增加而增加，呈一定的时间，剂量依赖性关系。对ALO作用24、48、72h的抑制率进行Probit回

8、归分析，结果显示其IC5