骨髓间充质干细胞颈内动脉移植治疗血管性痴呆大鼠的实验研究

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofDoctorTheResearchontheTherapeuticEffectofIntracarotidTransplantationofBoneMesenchymalStemCellsonVascularDementiaRatsByChangmingWang一Supervisor：Prof．JunfangTengMajor：NeurologyDepartment：MedicalschoolMar,2014原创性声明II

2、IIIIIIIUlIIIY2545159本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：)咿／o年j，月≯召日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授

3、权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：0身吁日期：矽／￥年j7月毯日摘要骨髓间充质干细胞颈内动脉移植治疗血管性痴呆大鼠的实验研究博士研究生王昌铭导师滕军放郑州大学第一附属医院神经内科(郑州45000)摘要背景与目的+成年哺乳动物的神经元缺乏再生能力，中枢神经系统(centralneuralsystem，CNS)损伤后的修复相当困

4、难。目前人们将精力集中在干细胞移植治疗脑和脊髓病变上【卜6】。胚胎干细胞移植是治疗CNS疾病最有希望的手段之一【7。引，但其受取材困难、免疫排斥和伦理学等因素的限制【9J。骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymalstemcells，BMSCs)是具有高度自我更新、活跃增殖和多向分化潜能的干细胞【10-11】，其取自自体，抗原表达弱，引起的免疫排斥和移植物抗宿主反应低，且来源丰富，取材简便，易于体外分离、纯化和培养，并增殖速度快，能够满足细胞移植所需数量，具有广泛的科研和临床应用价值。BMSCs在体外适当的条件下经培养诱导后高表达神经细胞特异性

5、标志物，如nestin、13-tubulinlII、MAP2、GFAP、NeuN等【12】，并定向分化为神经元和神经胶质样细胞【l3。20】；且在脑外伤、脑血管疾病、中枢神经系统变性疾病等方面取得了一定的效剁2a21’261。血管性痴呆(vasculardementia，VD)是由各种脑血管因素导致脑组织损害引起的智能障碍综合征，严重影响中老人的健康，发病率逐年上升，至今尚无特效疗法。因此，积极开展BMSCs移植治疗VD的基础与临床研究意义深远。本研究将BrdU标记的BMSCs经颈内动脉输注入VD大鼠体内，观察BMSCs透过血脑屏障(bloodbra

6、inbarrier，BBB)在脑实质内存活、迁移和分布情况，并观察大鼠行为和认知功能、脑组织病理结构变化，同时探讨BMSCs对脑内周围生长相关蛋白．43(Growthassociatedprotein．43，GAP．43)、海马区细胞摘要凋亡和胆碱能系统以及血清神经元特异性烯醇酶(Neuronspcificenolase，NSE)与S．100蛋白含量的影响，阐明颈内动脉移植BMSCs对VD大鼠神经功能恢复的可行性和有效性。方法1．BMSCs的提取、分离、培养和扩增采用淋巴细胞密度梯度分离法和贴壁法。2．BMSCsBrdU标记在加入20ng／mLNGF

7、、RA基础上，加入BrdU使浓度为5I，tmol／L，在37。C、5％C02饱和湿度的培养箱内培养诱导分化48h。3．实验动物分组随机分对照组(n=126)、模型组(n=126)31治疗组(n=126)；又分2、4、8W三个时相点。4．动物模型改良的Pulsinellis四血管阻断法建立VD模型。治疗组于术后24h颈内动脉输入BMSCs，浓度为1．2×101／mL，注射剂量O．5mL。5．脑组织内BMSCs检测采用S-P免疫组化法检测BMSCs在脑内的存活、迁移及其分布特点。6．脑组织内GAP．43和海马区(Cholineacetyltransfer

8、ase，CHAT)表达采用S．P免疫组化法。7．海马凋亡细胞检测采用TdT介导的dUTP缺口末端标记(Ter