利用talen技术和猪胰岛素启动子pip制备gtkolea29y转基因猪

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationProductionofGTKO／LEA29YtransgenicpigsbyusingtheTALENandporcineinsulinpromoterAuthor：Supervisor：YuShuzhenProf．LiXueweiProf．PanDengkeMajor：AnimalGeneticsandBreedingSpecialty：MolecularGeneticsandBreeding2014．6万方数据指导小组成员本研究得

2、到国家高技术研究发展863计划(2013zx08010006)、长江学者和创新团队发展计划(IRTl3083)项目资助本论文在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所完成兀，珑万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：奇舞谚印仲年矿月夕日关于

3、论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。(请在以上口内划“√’’)研究生签名榭导师签名：口本论文保密，在一年解密后适用本授权。∥件年石月夕日p胖年∥月9日万方数据四川农业大学硕士学位论文摘要目前，糖尿病已成为威胁全人类健康的重要疾病之一。研究证明，移植胰岛是治愈糖尿病重症患者的有效方法，

4、但该医学方法的发展却受到了器官来源不足的制约，而异种移植是解决临床器官移植供体来源短缺的有效途径。在异种器官移植中面临着超急性排斥反应，O【一1．3半乳糖苷转移酶基因GGTAl敲除的成功基本上解决了这个问题，然而T细胞的排斥反应仍然是制约异种器官移植发展的一大瓶颈。LEA29Y是一种能够高效抑制T细胞活性的新型融合蛋白，该蛋白的广泛性表达容易导致转基因动物免疫力低下而不易存活，因此，制备胰岛特异性表达LEA29Y的GGTA1基因敲除(GTK0)猪对于解决异种胰岛移植的排斥反应具有重大意义。本研究利用猪胰岛素启动子(porcineinsulinpro

5、moter，PIP)和牛生长激素polyA(bGHpA)，构建胰岛B细胞特异性表达LEA29Y载体，同时利用TALENs诱导的NHEJ对GGTAl基因进行敲除，得到了如下结果：1、利用PIP(包括猪胰岛素基因第1外显子和第1内含子)和bGHpA构建表达框，考虑到酶切位点插入不同位置可能对启动子效率造成影响，构建了3种表达载体。通过实验分析比较，发现将PIP的内含子拼接位点突变为H／ndIII内切酶识别位点后，第1内含子不剪切，但是可以介导下游基因稳定高效地表达，可以作为后续试验中胰岛特异表达目的基因的理想表达框。2、用1．2kb的LEA29Y基因取

6、代胰岛D细胞特异表达框中EGFP基因序列，体外转染MIN．6小鼠胰岛细胞和猪耳成纤维细胞，通过RT-PCR和WesternBlot检测发现LEA29Y只特异地在D细胞中表达，与预期结果一致，表明该载体可以用于后续的细胞转染和筛选，为制备胰岛特异表达LEA29Y转基因猪奠定了基础。3、根据五指山小型猪基因组序列设计敲除GGTAl基因的TALEN质粒，与胰岛特异性表达LEA29Y基因的质粒共转五指山小型猪耳成纤维细胞，筛选获得理想的GTKO／LEA29Y单细胞克隆，通过体细胞核移植获得GTKO／LEA29Y阳性胚胎，胚胎移植后期待获得GTK0／LEA2

7、9Y转基因阳性猪，为解决异种移植中的超急性排斥反应和T细胞排斥反应奠定了基础。关键词：猪胰岛素启动子，LEA29Y，GTKO，转基因猪万方数据叫川农业人学硕士学位论文ProductionofGTKO／LEA29YtransgenicpigsbyusingtheAbstract：TALENandporcineinsulinpromoterByShuzhenYu(AnimalGenetics，BreedingandReproduction)DirectedbyProf．XueweiLiandDengkePanNowadays，diabeteshasbe

8、comeaglobalthreatofhumanhealth．IslettransplantationISaneffect