两种不同细胞颗粒分泌机制的初步研究

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1、华中科技大学硕士学位论文两种不同细胞颗粒分泌机制的初步研究姓名：许亮申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：徐涛20040507华中科技大学硕士学位论文摘要真核细胞一般通过囊泡(vesicle)完成生物分子的跨膜运输，且细胞内不同囊泡肩负不同物质的运输任务。我们成功的在PCI2细胞中用荧光蛋白标记了两类囊泡，并研究了它们在转运过程中的动力学特性及分子机制。虽然很多细胞是通过囊泡运输各种物质的，但在有些细胞中，如自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞，却是通过分泌溶酶体(secretorylysosome)运输各种生

2、物分子的。自然杀伤细胞对癌细胞、病毒、胞内寄生菌和老化变异细胞都具有极强的清除能力，对其分泌机制的研究将有助于攻克某些人类疾病。目前我们已经成功的对自然杀伤细胞中分泌溶酶体的分泌调节机制进行了初步研究，同时对其生成途径有了一定的了解。1．采用全内反射荧光显微技术(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,TIRFM)在PCI2细胞中研究致密核心大囊泡(1argedense．coredvesicles，LDCVs)和类突触小囊泡(synapficvesicle—likemicrov

3、esicles，SLMVs)的转运和分泌机制差异。我们用红色荧光蛋白2(discosomasp．redfluorescentproteinvariant2，DsRed2)与神经肽Y(neuropeptideYNPY)融合标记大囊泡，用绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)与囊泡乙酰胆碱转运载体(vesicleacetylcholinetransporter,VAChT)融合标记小囊泡。结果显示在5raM外钙环境下，两种囊泡动力学特征没有显著差异，同时在膜下SLMVs的数目远多于L

4、DCVs。2．用FMl—43染色发现自然杀伤细胞在100n／vl的PMA作用5min后就会出现分泌现象。使用光学切片技术发现吖啶橙(acridineorange，AO)标记的自然杀伤细胞在内皮细胞活化后或者在PMA刺激后其内部的分泌溶酶体数量会大量增加，这种现象会被蛋自激酶C(proteinkinaseC，PKC)的抑制剂G66983阻断，同时用BrefeldinA(BFA)破坏高尔基体不能阻碍分泌溶酶体的增加，从自然杀伤细胞的三维重组模型得到的分泌溶酶体的分布情况进一步证实了以上现象。以上证据说明分泌溶酶体的产生有蛋白激酶c信

5、号通路的参与而且其来源不是高尔基体。关键词：分泌；类突触小囊泡；致密核心大囊泡；全内反射荧光显微镜；分泌溶酶体，蛋白激酶C华中科技大学硕士学位论文．AbstractNommlly,vesiclesareusedtotransportcargomoleculesineukaryoticcells．Differenttypesofcargomoleculeshavedifferenttraffickingmechanism．Inthispaper,wehavesuccessfullylabeledtwodifferentkindso

6、fvesicleswithfluorescentproteintostudythedynamics，molecularmechanismoftheirtraffickinginPCI2cells．Althoughvesiclesareusedinmanycellstotransportcargomolecules，somecells,、_suchasnaturalkiller@K)cells，usesecretorylysosomes．NKcellsareabletokillcancercell，vires，parasitica

7、lbacteriaincellsandagingormutantcells．TocladfythemechanismofthesecretionofNKcellsiShelpfulforUStotreatsomehumandiseases．WehavestudiedthesecretionandregulationmechanismofthesecretotylysosomesinNKcellsMeanwhile，theirbiogenesiswasstudied．1．TotalInternalReflectionFluores

8、cenceMicroscopy(TIRFM)wasemployedtostudythedifferenceintraffickingandsecretionbetweenlargedense—coredvesicles(LDCVs)andsynapticvesi