转vegf内皮细胞株的建立及其对平滑肌细胞增殖的影响

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1、重庆大学硕士学位论文转VEGF内皮细胞株的建立及其对平滑肌细胞增殖的影响姓名：罗彩凤申请学位级别：硕士专业：生物学指导教师：王贵学20120606中文摘要摘要动脉粥样硬化疾病(AS)属于心血管疾病中的一个大类，它严重影响着人们的健康。冠状动脉支架植入已是治疗该疾病的重要手段。但是支架的植入会再次引发支架内再狭窄的发生，目前，抑制血管支架再狭窄的主要途径是采用药物洗脱性支架，药物洗脱支架明显的降低了再狭窄发生的概率，但再狭窄的问题仍然无法避免，其原因在于药物在阻断血管平滑肌细胞(、协cularSmoomMuscleCells．VSMCs)增生

2、的同时也抑制了内皮细胞(EndoⅡlelialCells，ECs)的增殖，进一步延缓了手术后的再内皮化进程，从而导致再狭窄。血管ECs和VSMCs之间的相互作用是不同心血管疾病发展的基础，内皮层血管壁内膜在植入支架的过程中很容易被损坏。血管壁损伤后，VSMCs从静态的收缩表型分化为有利于迁移，增殖，最终导致血管再狭窄。因此加速血管内皮化是防止血管再狭窄的可行性措施。本文通过构建组织工程细胞，用作支架种子细胞，以期种植到支架表面后能以加速ECs的增殖、迁移，促进血管内皮化，以此来抑制VSMCs的增殖，及防止支架再狭窄的发生。同时利用Trall

3、swell共培养模型与大鼠VSMCs进行共培养，从而研究联合培养调节下的稳定表达VEGFl2l的ECs对VSMCs增殖的影响。全文研究结果如下：①利用I心A干扰技术构建2种pSilencer3．1．VEGFl21．shI斟A真核干扰表达载体和一种阴性干扰载体，通过潮霉素筛选稳定转染的细胞，同时复苏本实验室保存的可以稳定表达的pIRES2．EGFP．VEGF过表达ECs，通过WeStemblot及RT．PCR检测种子细胞VEGF蛋白和VEGF基因的表达，同时筛选出抑制效率最高的pSilencer3．1一VEGFl2l-sbRNA2表达质粒，结

4、果证实具有稳定表达不同水平VEGF的ECs构建成功。②通过MTT法验证到稳定转染VEGF基因的ECs的增殖速度明显比对照组和VEGF干扰组快，且细胞的血管形成能力和迁移能力都明显高于对照组和干扰的细胞，转VEGF基因的细胞的NO分泌量较对照组与干扰组明显增加，并采用FITC．Phalloidin对Ecs的骨架进行染色，结果发现VEGF干扰组的细胞质F．肌动蛋白丝和肌动蛋白应力纤维减少，细胞外围边缘的F．肌动蛋白也明显减少，说明血管内皮细胞过表达VEGF可以促进细胞骨架的形成。③采用贴壁法成功培养并鉴定出原代大鼠平滑肌细胞，同时利用Trall

5、sweU共培养系统将ECs与大鼠的VSMCs进行共培养，结果发现共培养下稳定表达vEGF的ECs具有能够抑制VsMCs的DNA合成及其总蛋白合成的能力。重庆大学硕士学位论文总之，通过体外实验可以证实出转染VEGF基因的ECs不仅有助于促进ECs的增殖、迁移，加速内皮修复，同时也有能力抑制VSMCs的增殖。用转基因细胞的移植物修复受损的ECs有可能成为未来动脉粥样硬化和再狭窄治疗的一个新的有力的方法。关键词：血管内皮生长因子，内皮化，内皮细胞，平滑肌细胞II英文摘要ABSTRACTThecardioVascularandcerebr0Vasc

6、Illardiseasescausedbyatllerosclerosis(AS)aremeleadiIlgcallsesofmorbidi够aIldmoIrtalityamuIldthe、Ⅳ0rld．The瑚lpiddevelopmentand淅despreaduseofvariousvaScmarstentso虢rshopeforASpatients．In．stentrestenosisaRerstentimplantation，llo、veVer，isaIlunresolvedpmblemtllatlimitst11erapeutic

7、emcacy．A1t110u曲tlleclillicaluseofdrug-e1毗gstemsinrecentyearshasresultediIlasi鲥ficaIl“。edllCtionint11erateofrestenosis，restenosisremainsaproblem．Becausedrug-elutingstentsinducenon-specificantiproliferativee航ctsnotoIllyonVascularsmoothmusclecellbutalsoonoⅡ1ercelltypessuchase

8、ndotllelialcells，delayingVascularre-endomelializationprocess啦ersurgeⅨmmlerresuhinginreste