辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)肉碱酰基转移酶基因克隆及功能研究

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1、山东农业大学硕士学位论文辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsici）肉碱酰基转移酶基因克隆及功能研究姓名：孙冰冰申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：张修国20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要’辣椒疫霉菌(PhytophthoracapsiciLeonian)是一种普遍存在的土壤兼性寄生菌，能侵染包括辣椒、番茄、茄子、黄瓜、南瓜、甜瓜等多种茄科及葫芦科植物，在世界范围内广泛引起辣椒疫病。Leonian(1922)最早记载了发生在墨西哥的辣椒疫病，确定其病原菌为Phytophthoracapsici。辣椒疫病的发生严

2、重影响了辣椒的产量和质量，造成了巨大的经济损失。目前辣椒疫霉的防治还是以化学药剂防治为主，抗病育种工作进展缓慢，农药残留等问题仍然给辣椒生产、人类健康和环境安全带来了巨大威胁。因此，探索辣椒疫霉菌重要的致病因子及其致病机制成为了研究的重点。许多植物病原菌能形成称为附着胞的特异侵染结构，可以产生很大的机械压力。推动侵染菌丝侵入寄主组织。近年来，与附着胞相关的基因的研究越来越多，大多都集中在真菌领域，也有研究证明，卵菌菌丝生长的动力来自附着胞内的膨压(Bastmeyeretal。，2002)。据文献报道，编码过氧化物酶体型的肉碱酰基转移酶基因p

3、th2对稻瘟病菌附着胞的形成是必须的，经验证pth2基因的缺失突变株完全丧失致病性，这一结果与早期侵染过程中附着胞的功能丧失和侵染菌丝在寄主表面不能有效延伸有关(Gurpreeteta1．，2006)。因此，研究卵菌中与附着胞有关的基因意义重大。本研究以实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料，对辣椒疫霉中的肉碱酰基转移酶基因进行了以下研究：根据文献中报道的CAT基因，利用生物学软件从辣椒疫霉基因组中筛选CAT序列，然后再NCBI．BLAST在线比对，确认筛选的基因属于CAT基因家族；从本实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33基

4、因组中，成功克隆了两个CAT基因，PcCATl和PcCAT2，并在线比对和进行生物信息学分析；通过qRT-PCR技术对PcCATl和PcCAT2两个基因互作早期表达模式进行分析，结果显示两个基因均在游动孢子侵染辣椒寄主4h时高效表达；为了初步研究PcCATl和PcCAT2基因的功能，通过农杆菌介导的瞬时表达进行体外功能检测，nC彳丌和PcCAT2瞬时表达接种后均可产生褪绿症状，而且接种辣椒出现了枯死斑现象。说明了PcCATI和PcCAT2基因是起一定作用的功能基因；通过PEG介导的原生质体共转化技术获得PcCATl和PcCAT2基因沉默的转

5、化子，通过RT-PCR和qRT-PCR技术检测PcCAT基因的沉默效率并接种验证辣椒疫霉中CAT的功能，结果显示，基因沉默后，辣椒疫霉菌株SD33的致病力明显下降。通过苯胺蓝染色和免疫荧光染色实验，证实了PcCATl和PcCAT2基因辣椒疫霉菌(尸砂f叩，If向Dr口capsici)肉碱酰皋转移酶基因摩堕丝望壁至堑塑能影响互作早期侵染结构芽管和附着孢的形成。通过本研究，我们可以推测CAT基因在辣椒疫霉菌的致病过程中起作用，沉默转化子的成功筛选也证明了PEG介导的原生质体共转化技术在只capsici中可以实施，为辣椒疫霉的分子致病机制研究提供

6、了一种新的分子生物学技术。关键词：辣椒疫霉：肉碱酰基转移酶；农杆菌瞬时表达：基因沉默；致病性测定2Abstract‘、PhytophthD朋capsiciLeonian，aubiquitoussoilfacultativeparasite，canattacksolanaceousandcucurbithosts，whichincludepepper,tomato，eggplant，cucumber,pumpKln，melonandsoon，causingpepperblightdiseaseintheworld_wide．In1922，Le

7、oniandcscribedPcapsicfafterobservingablightofpeppersattheNewMexicoStation·Thepcpperblightdiseaseseriouslyaffectstheyieldandqualityofpepper,causmgeno肌ouscconomiclossesaswellasenvironmentaldamage．Now，thepreventionofP．capsicirelyonchemicalcontrol，progressofstudlesontheanti．di

8、seasebreedingisslow,pesticideresiduesandotherproblemsstillthreatenthepePPerproduction，hum