基于生物质谱的乙酸配稳定同位素标记

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1、第35卷分析化学(兀NXIHUAXUE)研究报告第12期2007年12月ChineseJoumalofAnalyticalChemistw1687~1695，’’t-.-..…:研究报告…基于生物质谱的乙酸配稳定同位素标记定量蛋白质组学方法的建立与优化刘新’，2，，应万涛‘，2，，周春喜‘，2，，蔡耘’，2，，钱小红’‘，2，，，(北京放射与辐射医学研究所，北京100550)2(北京蛋白质组研究中心，北京102206)3(蛋白质组学国家重点实验室，北京102206)摘要建立了一种基于生物质谱的乙酸醉稳定同位素标记，定量蛋白质组学研究方法，优化了影响

2、标记效率的各种条件。在pHS.0的NaZB;07/H3B03缓冲体系中，当乙酸醉摩尔浓度25倍过量于肤段摩尔量，22℃反应30min时，标记即可完全。对多对H6/D6一乙酸醉标记肤段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察，并通过串联质谱分析确定了乙酞化位点。结果表明:在10倍和30倍动态范围内，线性关系良好(r二0.99，r二0.98)，理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%。关键词乙酸配稳定同位素标记，定量蛋白质组学，生物质谱1引言定量蛋白质组学是对生物体在不同时间和空间或不同生理病理条件下，蛋白质表达量及其变化进行定量

3、描述的科学〔‘一’〕。定量蛋白质组学研究的常用方法主要有两种:一是基于双向凝胶电泳技术的定量方法。通过染色强度的差异，对蛋白质进行定量分析。荧光双向差异凝胶电泳(nuorescencetw。dimensionaldifferentialgelelectrophoresis，DIGE)作为近几年新发展的蛋白质组定量方法，相对于传统的双向电泳在灵敏度、动态范围和胶间的重现性方面都有显著性的提高〔4〕。但是，由于双向电泳本身的局限性，对于高疏水性、极酸极碱和大分子量蛋白质均不能很好地分离，一个染色点可能包含不止一个蛋白，难以实现自动化，以及DIGE试剂的

4、昂贵等缺点，限制了该方法在蛋白组学研究中的广泛应用[’月。二是基于稳定同位素标记和质谱联用的定量方法，由于突破了上述定量方法的众多瓶颈问题，正日益成为定量蛋白质组学研究中重要的技术方法〔’一9」。由于不同的蛋白质或者肤段在质谱中的离子化效率不同，所以，无法直接从质谱图上对其进行定量分析。将化学性质相同，但质量不同的稳定同位素作为内标，对不同生理或病理状态下表达的蛋白质或肤段进行标记，标记后混合样本，相同的蛋白质或者肤段因其质量差异在质谱图中出现一对特征性的同位素峰。由于它们具有相同的离子化能力，可以通过比较质谱峰的强弱，分析蛋白质在不同状态下表达量

5、的变化。目前，稳定同位素标记的定量方法主要有体内代谢标记和体外化学标记。体内代谢标记是通过在富含’SN一或‘3c一元素〔’“川或者含有稳定同位素标记的氨基酸〔‘，，‘，〕的培养基中培养细胞完成的。但是，使用同位素富集的培养基可能会影响细胞的生长和蛋白质的合成，造成定量不准确。使用稳定同位素标记的氨基酸对蛋白质进行代谢标记，虽然对于细胞的生长没有显著影响，但所需试剂费用很高。而体外化学标记是在蛋白提取后，对蛋白质或其酶解产生的肤段中的某个基团进行化学标记。Aebersold等〔‘4〕首先开发了稳定同位素标记亲和标签技术(isot叩e一coded戚n彻

6、tags，ICAT)，并已经商业化，得到广泛的应用。ICAT试剂由三部分构成，一是亲和标签，用于选择性富集被ICAT试剂标记的肤段;二是连接子(含有8个氢或氛原子，称为轻或重试2007刀1一17收稿;2007折一15接受本文系国家自然科学基金(No20405O17，No.20505018，No.20505019)、北京市科技计划重大项目(No.HD30230280190)、国家重点基础研究发展规划项目(No.2004CB518707)、国家自然科学基金重点项目(No.20635010)和国家科技计划课题(No.2006CB0D1600)资助课题*E

7、一m扭:示anxhl@yalloo.com.cn万方数据1688分析化学第35卷剂)，用于整合稳定同位素;三是活性基团，用于特异性标记半胧氨酸的琉基。ICAT试剂由于能够选择性富集只含有半胧氨酸的肤段，因而极大地降低了样本的复杂程度。但是大部分蛋白中半胧氨酸残基含量较少，经常是一个蛋白质只有1一2个肤段可提供定量信息，易造成定量结果与实际样本间的偏差较大。此外，复杂生物样本中有10%一20%的蛋白质不含半肌氨酸，使得ICAT方法的应用受到限制。综上所述，用于定量蛋白质组学理想的稳定同位素标记策略应该能够对不同来源的样本具有普适性，能对所有肤段进行标

8、记，应具有标记简单，反应条件温和，反应完全，标记产物稳定，试剂廉价等特点。本研究提供一种能够满足上述标准的体外化学标记方法