鸡ibv感染对气管黏膜固有免疫相关基因表达影响的初步研究

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1、广西大学硕士学位论文鸡IBV感染对气管黏膜固有免疫相关基因表达影响的初步研究姓名：侯金莲申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：磨美兰20120630鸡IBV感染对气管黏膜固有免疫相关基因表达影响的初步研究摘要鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis，IB)是给养鸡业带来很大经济损失的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病，是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)引起的。IBV属典型的嗜黏膜病原，其通过呼吸道黏膜途径侵入机体后，扩散到全身，引起机体广泛部位的黏膜上皮细胞损伤

2、。因此开展IBV黏膜免疫研究的重要性无容置疑。IBV致病机制研究是IB预防控制的主要方向之一，黏膜免疫研究是IBV致病机制研究的重中之重。固有免疫在机体非特异性抗感染免疫过程、特异性免疫应答的启动、调节和效应阶段发挥着重要作用。目前有关鸡IBV感染对气管黏膜固有免疫相关基因表达影响的研究比较欠缺。本研采用SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法，检测IBv广西变异株分离株GX．YL5感染健康阴性鸡后1、3、5、8和12d鸡气管黏膜模式识别受体(TLR2、TLR3、TLR6、TLR7)、细胞因子(IL一10、IL．6、IL．10、IF

3、N．Q、IFN．13、Mx)、趋化因子与免疫细胞运输因子(CXCR4、CCR6、MMP3、MIP．113)共14个固有免疫相关基因mRNA表达动态，同时在5个候选内参基因ACTB、TBP、GAPDH、18SrRNA和28SrRNA中进行最佳内参基因选择的研究。根据GenBank上TLR2、TLR6、TLR7、IL．1B、IL．6、IL．10、IFN．B、CXCR4、CCR6、MMP3和MIP．10mRNA的基因序列，在保守区设计并合成了各自的特异引物；TLR3、IFN．Q、Mx、ACTB、TBP、GAPDH、18SrRNA和28SrR

4、NA参考已发表的引物。应用RT-PCR技术，分别扩增出19个基因的目的片段，PCR回收纯化的产物作为标准品进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR来构建标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果显示，各标准曲线的直线相关系数R2均大于0．992，且扩增效率在94％．102％之间；熔解曲线分析结果显示所建立的方法特异性好，溶解曲线均出现单特异峰。应用已建立的实时荧光定量PCR检测方法，对5个候选内参基因ACTB、TBP、GAPDH、18SrRNA矛128SrRNA在IBV(GX．YL5)感染后不同时相鸡的气管黏膜中的表达情况进行检测。然后用g

5、eNorm、NormFinder、BestKeeper矛N比较△Ct共4种分析方法对荧光定量PCR数据进行分析得出基因的表达稳定值。最终筛选出ACTB、GAPDH和TBP作为合适的内参基因，用于校正IBV(Gx．YL5)感染后不同时相鸡气管黏膜中其它目的基因的差异表达。II应用已建立的实时荧光定量PCR检测方法，对IBV(GX．YL5)感染健康阴性鸡后1、3、5、8和12d鸡气管黏膜模式识别受体(TLR2、TLR3、TLR6、TLR7)、细胞因子(IL-1B、IL．6、IL．10、IFN．Q、IFN．B、Mx)、趋化因子与免疫细胞运输

6、因子(CXCR4、CCR6、MMP3、MIP．1B)共14个固有免疫相关基因IIl】[淤A表达动态进行了检测。并以ACTB、TBP和GAPDH作为内参基因，用pfaffl法进行相对定量分析。结果表明攻毒后ld，MX、TLR2和TLR7的mRNA表达出现明显上调；攻毒后3d，CXCR4和MP．1B的mRNA表达出现明显上调，IFN．的mRNA表达上调更为明显；攻毒后5d，IL．1D的mRNA表达出现明显上调，IFN．B的mRNA表达上调最为明显；攻毒后8d，IL．I[3币DMIP．I[3的mRNA表达出现明显上调；攻毒后12d，TLR2

7、和IL．6的mRNA表达出现明显上调；其qbIFN．p在攻毒后3和5d差异性表达极为显著，分别高达97．51倍幂D165．54倍。提示IFN．p在抗IBV感染早期的固有免疫应答中可能发挥重要的作用。本研究获得IBV(GX．YL5)感染后鸡气管黏膜固有免疫相关基因表达动态的初步资料，从分子水平解析了鸡IBV感染对气管黏膜的固有免疫的影响作用和途径，揭示鸡IBV感染对气管黏膜固有免疫作用的分子机制，丰富了鸡的粘膜免疫研究的数据和体系，为黏膜免疫的基础机理及诱导黏膜免疫反应的佐剂的研究提供科学依据。关键词：传染性法支气管炎病毒；黏膜免疫；固

8、有免疫；实时荧光定量PCRIII’’’‘prelimin3'studytheeffectofavianIBVinfectionlhepreliminarystudyontheetlectoi-aviantioctiono