丝裂原激活蛋白激酶对金鱼发育的调控作用

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1、湖南师范大学硕士学位论文丝裂原激活蛋白激酶对金鱼发育的调控作用姓名：黄明敏申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：李万程20050401摘要丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinases，MAPKs)是细胞内的至关熏要的蛋白激酶。研究证实，MAPK信号转导通路存在于大多数细胞内，将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用。MAPK可分为三个主要的亚群，即细胞外信号调节激酶(ERK)，应激活化蛋白激酶(YNK)和p38MAPK。本文应用WesternBlot

2、分析、免疫沉淀、激酶活性分析、显微注射等技术研究和探讨了MAPK对金鱼发育的影响和调控作用。所得实验结果如下：(1)MAPK三种主要成员在金鱼的晶体上皮、晶体纤维、视网膜、大脑、心脏以及肌肉六种组织中的表达和活性存在着组织特异性。ERK的表达和活性水平最高，在金鱼的六种组织中都存在着强烈的表达和活性水平；JNKl只在晶体纤维、视网膜、大脑和心脏中表达，在晶体上皮中的表达极其微弱；JNK2在视网膜、心脏、大脑以及肌肉组织中均有一定程度的表达；但在晶体上皮，JNK2只有微弱的表达；p38在金鱼的视网膜、大脑、一tb脏以及肌肉中存在表达，而在晶状体的上皮和纤维中没有表达，在

3、金鱼六种组织中不存在p38的磷酸化活性。(2)比较和检测了金鱼单倍体胚胎与二倍体胚胎的MAPK的表达差异。在尾芽时期，不同倍性的胚胎内的ERK蛋白总量存在着明显差别。单倍体胚胎的ERK表达水平要高于二倍体胚胎内的ERK表达。在色素期，ERK在正常自交二倍体胚胎中的表达水平上升，与单倍体胚胎之间的ERK表达差异程度不如尾芽期明显。而在眼睛不正常的单倍体胚胎中完全缺少了JNK的表达和活性。(3)将RAF、MEK、ERK的显性突变体基因通过显微注射转染至金鱼的受精卵，分析了当MAPK信号通路被抑制后对金鱼发育的影响。通过激酶活性分析证实注射的DNMRAF，DNMMEK，DN

4、MERK使金鱼胚胎的内源性RAF、MEK、ERK的活性被抑制。对注射了DNMRAF，DNMMEK，DNMERK的金鱼胚胎的连续的娃微观察发现，当注射了这些显性突变体基因后对金鱼的胚胎发育产牛了强烈的干扰作用，导致胚胎的发育迟缓，器官发生出现明显畸形。如眼睛晶状体形状不正常，色素分布不均匀，胚胎的体节数目减少，尾柄弯曲，心跳频率减慢，肌肉效应不明显，胚胎的死亡率高等。由这些实验结果得出以下结论：RAF／MEK／ERK蛋白激酶是金鱼体内一条重要的信号转导通路，它在金鱼的各种组织器官中存在着较高的表达与活性，与金鱼的器官发生，特别是眼睛的发育关系密切；当抑制金鱼的RAF／M

5、EK／ERK信号转导后，会导致金鱼的胚胎发育受阻，证明RAF／MEK／ERK通路对于金鱼的正常胚胎发育和生存是必不可缺的。关键词：MAPK，蛋白质印迹，显性突变体基因，金鱼IIABSTRACTMitogen．activatedproteinkinases(MAPKs)，afamilyofspecialproteinkinases，existinmostcellsandplaysignificantrolesinsignaltransductionfromextra-cellularcircumstancestonuclei，whichmediatevariouscel

6、lularprocessessuchasproliferation，differentiation，transformationandapoptosis．ThroughWesternblotanalysis、immunoprecipitation，linkedkinaseassays、andmicroinjectionofthedominantnegativemutantRAF，MEKandERK，theexpressionpattemsofMAPKsandthefunctionoftheERKsignalingpathwayondevelopmentofgoldfi

7、shhavebeeninvestigatedandtheresultsaresummarizedbelow：(1)ThethreetypesofMAPKsaredifferentiallyexpressedinlensepithelium，lensfiber，retina，heart，brainandmuscleofgoldfishwithdistincttissuespecificity．AmongthreetypesofMAPKs，theexpressionandactivitiesoftheextracellularsignal—regulat