丝裂原激活的蛋白激酶激酶2对猪瘟病毒复制的调控作用

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1、分类号：Q959.7单位代码：10193密级：公开学号：2012629硕士学位论文丝裂原激活的蛋白激酶激酶2对猪瘟病毒复制的调控作用RegulationofthereplicationofClassicalswinefevervirusbymitogen-activatedproteinkinasekinase2作者姓名：王竞晗学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物疫病病原学指导教师：赵权教授所在学院：动物科学技术学院2015年4月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论

2、文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫

3、描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要猪瘟（Classicalswinefever，CSF）是严重危害世界和我国养猪业的一种急性、热性、高度接触性和致死性传染病，以高热稽留、广泛性出血和免疫抑制为主要特征。猪瘟的病原是猪瘟病毒（Classicalsw

4、inefevervirus，CSFV）。CSFV是黄病毒科瘟病毒属的重要成员，其长约12.3kb的单股正链RNA基因组仅含有一个大的开放阅读框（Openreadingframe，ORF），编码一个分子量约438kDa的多聚蛋白，该多聚蛋白被病毒和宿主蛋白酶水解为8种非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）和4种结构蛋白（C、Erns、E1和E2）。丝裂原激活的蛋白激酶激酶2（Mitogen-activatedproteinkinasekinase2/extracellularregulatedkinase，MEK2）是细胞外信号调节激

5、酶（Extracellularsignaling-regulationkinase，ERK）信号通路的重要激酶。此外，MEK2还参与丙型肝炎、登革热等病毒的复制，而且MEK2与CSFV之间存在相互作用。CSFV感染PK-15细胞后能够激活宿主的ERK通路并促进MEK2的表达，应用特异性抑制剂阻断ERK信号通路能明显抑制CSFV复制。为了进一步研究MEK2对CSFV复制的影响，本研究利用慢病毒载体系统分别构建MEK2上调表达的PK-15稳定细胞系（PK-EGFP-MEK2）和MEK2下调表达的PK-15细胞系（PK-shMEK2），通过流式细胞术筛选EGFP阳性细胞，免疫荧光试验

6、和Westernblotting试验证实MEK2上调和下调表达的细胞系构建成功。细胞增殖试验表明MEK2上调和下调后均不影响细胞的活力及增殖水平。将所构建的细胞系进行CSFV感染试验，分别在病毒感染后的48h和72h，收集病毒感染样品，进行荧光定量RT-PCR和病毒效价的测定，并对感染后的细胞蛋白进行Westernblotting检测以及荧光素酶报告系统检测等试验明确MEK2对CSFV复制的影响。结果显示，过表达MEK2能够明显提高病毒RNA拷贝数和病毒滴度，细胞裂解物中病毒Npro蛋白的表达量增加，表明上调表达MEK2可以促进CSFV的复制。相反，下调表达MEK2的细胞培养上

7、清中病毒RNA拷贝数和病毒滴度明显低于对照组，细胞裂解物中Npro蛋白的表达量也显著减少，表明下调表达MEK2能够明显抑制CSFV的复制。总之，本研究发现宿主蛋白MEK2能够正调控猪瘟病毒的复制。关键词：猪瘟病毒；丝裂原激活的蛋白激酶激酶2；病毒复制；慢病毒载体IAbstractClassicalswinefever(CSF)isahighlycontagiousandoftenfataldiseasethataffectsdomesticpigsandwildboars,character