实验5金黄色葡萄球菌的检验

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1、实验5金黄色葡萄球菌的检验1目的和要求（1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法（2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理2基本原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。因此,检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌

2、落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。3实验材料3」检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料3.2菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。3.3培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基3.4试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。3.5仪器与其他用具无菌吸管（ImL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。4检样程序5操作步骤5.15.1.1样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯

3、化钠肉汤或10%氯化钠胰酪脓大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min〜10000r/min均质1min〜2min,或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪淼大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min〜2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪脓大豆肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。5.1.2增菌和分离培养5.1.2.1将上述样品匀液于36°C±1°C培养18h〜24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重

4、时在10%氯化钠胰酪腺大豆肉汤内呈混浊生长。5.1.2.2将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36°C±1°C培养18h〜24h。Baird-Parker平板36°C±1°C培养18h〜24h或45h〜48h。5.1.2.3金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm〜3mm,颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典

5、型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。5.1.3鉴定5.1.3.1染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5pm〜1pm。5.1.3.2血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36°C±1£培养18h〜24h。取新鲜配置兔血浆0.5mL,放入小试管中，再

6、加入BHI培养物0.2mL〜0.3mL,振荡摇匀，置36°C±1£温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h,如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI,36°C±1*培养18h〜48h,重复试验。病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。5.2金黄色葡萄球

7、菌Baird-Parker平板计数5.2.1样品的稀释5.2.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min〜10000i7min均质1min〜2min,或置盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打lmin〜2min,制成1:10的样品匀液。5.2.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。5.2.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸

8、取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支lmL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。5.2.1.4按5.2.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增