omega--3多不饱和脂肪酸通过影响mir--146b的表达实现对炎症的调节

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1、分类号：R151．4；Q782UDC：577：602：614密级：不保密学校代码：·-ossIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIJIWF2814436毒鼻大季博士学位论文Omega-3多不饱和脂肪酸通过影响miR一146b的表达实现对炎症的调节指导教师学科专业名称论丈提交日期玲丈答辩日期答辩委舞会童席郑征葛银林教授病原生物学宋微波教授摘要Omega-3和Omega-6多不饱和脂肪酸已被证明能够在体内调节机体的炎症状态，而microRNA这种内源性非编码的短链RNA能够被多种多不饱和脂肪酸调节并进一步引起机体多种生物学途径的变化。Omega。3和Omega-

2、6多不饱和脂肪酸能否通过调节microRNA来调节机体炎症水平、具体通过什么途径调节炎症，是本文讨论的重点。实验首先建立了分别由Omega．3和Omega-6多不饱和脂肪酸饮食诱导的、具有抗炎倾向(anti．inflammation)或促炎倾向(pro．inflammation)的大鼠模型。通过对两类大鼠模型血清中的炎症因子，包括白介素6(Interleukin-6，IL6)、快速反应蛋白(C．reactiveprotein，CRP)、肿瘤坏死因子仅(TNF．0【)的表达水平的检测，验证实验对象适合进一步筛选候选microRNA实验需要。同时这些结果也进一步证

3、明Omega-3多不饱和脂肪酸显著的活体水平抗炎作用，包括对炎症因子的调节和对大鼠肥胖程度的影响。接下来通过microRNA芯片实验，筛选出分别在Omega-3和Omega．6多不饱和脂肪酸饮食诱导炎症模型中上调和下调的microRNA。通过显著性分析、聚类分析和功能分析进行第一轮筛选，选出最有可能参与炎症调节的候选microRNA来进行实时定量PCR的验证。通过以stem．100p反转录引物为基础的实时定量PCR实验，确定出在多种多不饱和脂肪酸代谢相关的器官中被Omega．3和Omega-6饮食调节的microRNA。进一步，通过生物信息学数据库和软件，预测

4、这些microRNA的靶基因，并对靶基因所处的免疫调节相关通路进行功能聚类分析。结合文献和聚类分析富集评分选取miR-146b作为最终实验对象，进行人类细胞水平的microRNA抑制实验和萤光素酶报告载体验证实验，证明了miR-146b能够在脂肪细胞中直接参与抑制Smad4的翻译过程。本文成功构建多不饱和脂肪酸诱导的大鼠炎症模型，迸一步印证了文献报道的Omega-3抗炎作用和Omega．6促炎作用。借助该模型，结合传统生物学实验和新兴的生物信息工具，筛选出受到Omega．3和Omega-6多不饱和脂肪酸调节的并且呈现上、下调两极分化趋势的microRNA分子，

5、并通过实时荧光定量实验验证Omega．3多不饱和脂肪酸在大鼠脂肪细胞中抑制miR．146b表达的作用。萤光素酶报告系统确认miR-146b能够直接调节TGF．p信号转导通路中的重要调节基因Smad4，并且能够在提高Smad4在大鼠脂肪细胞中的表达，再加上TGF．B信号通路是典型的免疫负调节途径，本文提出，Omega-3多不饱和脂肪酸能够通过降低miR-146b的表达，使TGF．p信号通路中的Smad4基因水平升高，增强TGF．p的生物学功效，进而发挥其抑制炎症的作用。关键词：Omega一3多不饱和脂肪酸；microRNA；炎症；Smad4；TGF-pAbstr

6、actObjectiveMicroRNAs(miRNAs)aresmallendogenousnon-codingRNAsinvolvedinposttranscriptionalgeneregulationthathavecrucialrolesinseveraltypesoftissues．Polyunsaturatedfattyacids(PUFAs)aredietaryfactorsthathavepotentialabilitytofacilitatereductioninflammationandmaintainimmunehomeostasis。

7、OuraimistodeterminetherolesandmechanismsofmicroRNAinPUFA．modulatedimmunehomeostasispathwaysinthispaper．MethodsThree-week—oldWistarratswereseparatedandtreatedbyOmega-3dietandOmega-6dietrespectivelytobuildP嗽diet-inducedautoimmune(AI)-proneandAI—averseratmodels．FlowcytometryandELISAass

8、ayWasconductedtodet