peroxiredoxin+i：一个fas%2ffasl途径中新细胞凋亡抑制基因

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1、中南大学博士学位论文PeroxiredoxinI：一个Fas/FasL途径中新的细胞凋亡抑制基因姓名：陶立坚申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：李桂源20040401PeroxiredoxirlI：一个Fas／FasL途径中靳的细胞凋亡抑制基鑫摘要细胞凋亡(apoptosis)是基因调控下的细胞自杀活动。机体在正常及病理情况下，细胞凋亡均发挥重要作用。在正常枫体内，绷胞璃亡参与细胞的曼耨、清豫老化细胞和有害细腱；在瘸理情况下，细胞凋亡异常可导致机体产生肿瘸、免疫功能降低、肾纤维化和心力衰竭等。缨旋鞠亡过程受众多基爨麴灞控。有戆基因霹瓣裁蠲巍弱亡，懿Bcl-2；有些基因可以促进

2、细胞凋亡，如p53、Fas．有些基因既可以促进，也可以抑制细胞凋亡，如c—Myc。Fas是肿瘤坏戮因子受体家族的缨臌表露分子，Fas分子爨为45KD，入的Fas基因定位子10q23。Fas较广泛的存在于人体多魏细胞；FasL是肿瘤坏死因予家族的细胞表面分予，FasL主要表达于活化的T细胞。FasL与Fas结合可导致细胞凋亡。层前已知某些基因可影响Fas／FasL途径诱导的缓胞凋亡，翔Bcl一2、c-Myc、李枣经酝胺等。本研究利用Fas／FasL途径诱导的细胞凋亡模型，将前列腺癌eDNALibrary转入NIH3T3／Fas细胞中，采用抗Fas抗体(CH-I1)药物筛选及生物信息等方法，拟发

3、溪有捧剑细胞凋亡{筝耀的薪基因，并对竟隆的薪基因避行生物学功熊的初步研究。为了获得Fas途径新的抑制细胞凋亡的基因，本研究在建5兢NZH3T3／Fas细胞系的基础上，首先用不同浓度的抗Fas抗体(Anti-FasAb，CH-II)处理嚣IH3T3／Fas囊tt隧，寻找辨ll杀死黪奄K王珏豁3／Fas细胞的娥小剂量。缀过实验，选择CH-11100ng／ml十Cyctoheximide(CHX)10ug／ml为进一步实验的剂量。将前列腺癌cDNALibrary转染至NIH3T3／Fas细胞后，溺c珏一11lOOng／ml+CHX10pg／瑶l处理。缀抗Fas抗体处瑾，筛选剿lO令可能禽有前列腺瘸

4、cDNALibrary的单克隆NIH3T3／Fas细胞。为了证实这10株可能含有前列腺癌eDNALibrary的NIH3T3／Fas缨蕤确安廷有撬Anti-FasAb翡功麓，我餐怒穗一ll100ng／ml◆CHX10Ⅱg／m1重复处理这10株细胞，再次确证这10株细胞具有抗TAnti—FasAb功能。为避免这10株细胞所获抗Anti—FasAb功能是由于丢失Fas所致，我们用免疫荧光方法检测这10株细胞，结果证明这10株细胞的Fas没有丢失。说明这10株细胞是由于转染了前列腺癌cDNALibrary后获得了抗Anti—FasAb功能。为寻找可能具有抑制细胞凋亡作用的新基因，我们首先获取这lO

5、株细胞的genomicDNA，然后用PCR方法，扩增这10株细胞genomicDNA中可能含有的前列腺癌cDNALibrary的片段。结果在24、34、4。、5。、10#细胞genomicDNA中发现有明确的PCR扩增片段。我们将3。细胞genomicDNAPCR扩增后的片段进行分离、纯化和进一步筛选，将筛选的PCR产物进行DNA测序，然后将DNA测序结果在GeneBank上对比，从中发现3。NIH3T3／Fas细胞genomicDNA的PCR扩增片段中含有PeroxiredoxinI和HexosaminidaseB基因。为进～步研究Peroxiredoxin-I(Prdx-I)和Hexos

6、aminidaseB(HexB)是否具有抑制细胞凋亡的功能，我们人工合成了PeroxiredoxinI和HexosaminidaseB，并将它们分别插入pcDNA3．0。将含有Prdx—I的pcDNA3．0和含有HexB的pcDNA3．O转染NIH3T3／Fas细胞后，再用cH一11处理。结果发现转入了Prdx-I的NIH3T3／Fas细胞的细胞凋亡较对照组明显减少，转入了HexB的NIH3T3／Fas细胞的细胞凋亡与对照组无明显差异。说明Peroxiredoxin-I具有明确的抑制细胞凋亡的作用。而HexB则无明确的抑制细胞凋亡的功能。PeroxiredoxinI是分子量为25KD的过氧化

7、物酶，定位于13q12。PeroxiredoxinI可以保护细胞免受活性氧自由基的损害，因此，PeroxiredoxinI很可能通过抗氧化作用来抑制Fas／FasL途径诱导的细胞凋亡。综上所述，在Fas途径诱导的细胞凋亡中，定位于13q12的PeroxiredoxinI具有抗Anti-PasAb的作用。PeroxiredoxinI可能是一个抑制Fas／FasL途径细胞凋亡的基因，进一步深入该基因的研究，将有利