人食管鳞癌耐药模型的建立和jp抗耐药肿瘤作用研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheestablishmentofdrugresistancehumanesophagealsquamouscarcinomamodelsandthestudiesonanti-drug—resistanceactivitiesandmechanismsofactionofByLiubinGuoSupervisor：AssocProf．CongWangMicrobialandBiochemicalPharmacySchooIofPharmaceuticalScienceApr

2、il，2014一，学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：·’。1：武日期：∥，彩年．么月钆日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部

3、分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者。翻。1日期：们，￥年．f月摘要肿瘤多药耐药严重影响化疗效果，甚至导致化疗失败，所以对于耐药机制及克服策略的研究尤为重要。本课题第一部分通过建立人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株及对应的体内耐药模型，初步探讨食管鳞癌紫杉醇耐药的耐药机制。第二部分利用第一部分建立的耐药模型，研究新型抗肿瘤化合物jP的抗耐药肿瘤作用及其机制。第一部分：人食管鳞癌体内外耐药模型的建立本部分采用高浓

4、度间歇诱导结合时间递增的方法建立了人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞模型，采用皮下移植的方法建立了对应的体内裸鼠移植瘤耐药模型，并探讨了两者的生物学特性及耐药机制。方法：以紫杉醇(Paclitaxel，PTX)为诱导药物，人食管鳞癌ECl09细胞为亲本细胞，应用高剂量间歇诱导结合时间递增的方法，历时6个月时间，建立了人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株ECl09／Taxol。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测耐药细胞对紫杉醇、5．氟尿嘧啶、表阿霉素、顺铂的耐药性；连续七个月监测耐药细胞的耐药稳定性：倒置显微镜及荧光显微镜观察紫杉醇诱导前后细胞和细胞核形态学变化；AnnexinV／PI双染色法检测细胞凋亡率；对

5、比ECl09与耐药细胞的生长曲线及倍增时间：平板克隆实验测定亲本细胞和耐药细胞的克隆形成能力；流式细胞术对比分析亲本细胞和耐药细胞的周期分布情况：Westernblot分析产生耐药前后细胞内Bcl．2、Bax、Proeaspase．3、P．gP蛋白的表达变化情况：耐药细胞罗丹明123(Rhl23)摄入／排出功能的检测；利用体外耐药模型，采用皮下移植法建立裸鼠移植瘤体内耐药模型，并对其耐药性进行鉴定。结果：耐药细胞株ECl09厂raXol对紫杉醇的耐药指数(RJ)为67．157，且耐药性稳定，同时对未接触过的5．氟尿嘧啶、顺铂、表阿霉素交叉耐药。ECl09厂raX01细胞形态不规则，体积偏小

6、，常趋于群集性生长，细胞核大而圆，结构完整，染色均匀。耐药细胞的自然凋亡率较亲本细胞低，100riMPTX诱导24h后，亲本细胞的凋亡率明显高于耐药细胞。耐药细胞的增殖速率及克隆形成率较ECl09细胞低，倍增时间延长。Go／Gl、S期比例增加，G2／M期减少。Westernblot结果显示，ECl09／Taxol细胞中Bcl．2、Procaspase．3、P．gP蛋白表达较I摘要ECl09细胞明显增加，而Bax的表达明显低于ECl09细胞。Rhl23摄入崩}出功能的检测表明ECl09／Taxol细胞P．gP的表达量及功能较ECl09细胞高。成功建立裸鼠移植瘤体内耐药模型，成瘤率为100％，

7、且存在明显的耐药性。第二部分：新型抗肿瘤化合物JP的抗耐药肿瘤作用及机制研究本部分主要是研究新型抗肿瘤化合物JP的抗耐药肿瘤活性，并探讨其作用机制。方法：选用人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株(ECl09／Tax01)与相应的敏感细胞株(ECl09)为研究对象，采用MTT法、生长曲线法、集落形成法测定口对细胞增殖的影响。流式细胞术检测JP对耐药细胞株周期分布的影响。Hoechst33258染色法、AnnexinV／PI双染法检测