海水养殖鱼类主要细菌病多联疫苗的研制及应用

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1、中国海洋大学硕士学位论文海水养殖鱼类主要细菌病多联疫苗的研制及应用姓名：刘斌申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：陈吉祥20070601独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得!洼!垫塑直基丝置噩鳖型直盟随：奎拦丑窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：刭纸签字吼母扫7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有

2、关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名别氓导师签字：签字日期：≯句年钿7日签字日期：学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：衙电话：邮编石月∥曰海水养殖鱼类主要细菌病多联疫苗的研制及应用摘要随着集约化、高密度养殖的迅速发展，海水鱼类养殖业遭受各种鱼类疾病暴发的困扰，严重影响了海水养殖业的发展。其中细菌性鱼病是危害养殖鱼类的一类

3、主要疾病，每年给水产养殖业造成重大的经济损失。多年来一直使用广谱抗生素和化学药物进行鱼类细菌病害的防治，致使病原菌的抗药性增加，且药物残留对水环境的污染日益严重，另外，药物残留还会对人体构成潜在的威胁。本论文针对海水鱼类频繁发生的细菌性疾病，进行了主要海水鱼类致病菌的优化培养，在此基础上进行了鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌多联灭活疫苗研制，并进行了多联疫苗对大菱鲆的免疫研究以及大肠杆菌表达的鳗弧菌外膜蛋白对海水养殖牙鲆的研究。分别进行了鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌的优化培养，测定了不同温度、盐度、培养基初始pH、培养基成分配比对四种

4、病原菌生长的影响，结果表明，鳗弧菌培养的最佳条件是：培养温度为28℃，培养盐度低于20，培养基初始pH范围在6．O～8．0。哈维氏弧菌培养的最佳条件是：温度为28℃、盐度为10～30、pH为5．O～9．0。副溶血弧菌的适宜繁殖温度为28℃、盐度为20～40、pU值为7．O～9．0。迟缓爱德华氏菌的适宜生长条件是：温度30"C、盐度10～20、pU6．O～7．0。制备了大菱鲆常见病原菌鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的联合疫苗，进行了大菱鲆的免疫研究。对海水养殖大菱鲆进行腹腔注射免疫，14天后用同样方法加强免疫一次，定期采血测定抗体凝集效价，70d后分别

5、用10L109cFU／ⅡlL的鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌腹腔注射感染免疫鱼。结果表明在免疫7d后大菱鲆血清中产生了四种病原菌的特异性抗体，并且在21～57d内达到高峰，鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的最高抗体效价分别是2“7、2”、2“和2“1，在70d时4种菌的特异性抗体仍维持较高水平，分另JJ是2”、2”、矛”和2“‘。70d时鳗弧菌、哈维氏弧菌人工感染大菱鲆的免疫保护力分别为66．67％、44．44％，而副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌感染的免疫保护力分别为20．00％和8．33％。海水养殖鱼类主要细菌病多联疫苗的研制及应用制备了

6、大肠杆菌表达的致病性鳗弧菌外膜蛋白，SDS．PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,WesternNot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。用不同剂量表达的鳗弧菌外膜蛋白对牙鲆进行了腹腔注射免疫研究，于28d后用鳗弧菌悬液(3．29×108CFU／m1)0．2ml对免疫牙鲆人工感染试验，结果表明用表达的鳗弧菌外膜蛋白免疫牙鲆，经人工感染后的免疫保护力分别为20．00％和33．33％。关键词：弧菌，多联疫苗，免疫应答，免疫保护率(RPs)2海水养殖鱼类主要细菌病多联疫苗的研制及应用DeveIopmentandappIicatiOnonpoIyvaIe

7、ntvaccineofbacteriaIpathogensofmarinefishAbstractCultureofmarinefishprogressestothelevelofllighdensityandiIltellsi劬accompaniedbyaprominenceofdiseaseproblem．Bacterialdiseasesarethemainpathogens．whichcancal】selarge-scalemortalitiesofmarinerisksandmasseconomicallossintheworld．Controloff