叶锈菌诱导的tclr24 cdna文库构建及gmp合成酶基因的克隆与分析

《叶锈菌诱导的tclr24 cdna文库构建及gmp合成酶基因的克隆与分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据分类号：S垒三5：121：垒三密级：公Ⅱ单位代码：学号：100862011353叶锈菌诱导的TcLr24cDNA文库构建及GMP合成酶基因的克隆与分析eDNALibraryConstructionofTcLr24inducedbyPucciniatriticinaandcDNAcloningandanalysisofgene学位申请人：谢欢指导教师：张娜副教授刘大群教授学科专业：植物病理学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一四年五月三十一日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下

2、进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰堡壅些盘堂或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：豫奴签字日期：如烨年6月罗日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解塑兰堡壅些盘堂有关保留及使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门(机构)送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查(借)阅。本人授权塑皇垦垒些盘堂可以将论文的全部或部分内

3、容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)学位论文作者签名：谢文导师签名：耀哪签字日期：为，￡卜年6月9Ft签字日期：70CtOq三6月jFt学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：万方数据摘要小麦叶锈病是由小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)引起的一种世界性小麦重要病害，抗病品种的选育和合理利用是防治该病最经济、有效和环保安全的方法。抗病基因的克隆及相关功能研究为基因的合理利用提供重要依据。小麦抗叶锈病基因Lr24来源于长

4、穗偃麦草(Agropyronelongatum)，国内外目前未见有对该基因有毒力菌株的报道。本研究以小麦抗叶锈近等基因系TcLr24幼苗为材料，构建受小麦叶锈菌胁迫的cDNA文库，并对文库进行了初步筛选；继而以一个TcLr24中特异表达的RNF片段为靶序列，通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得其cDNA序列全长，并构建的原核表达载体对该基因进行原核表达。主要研究结果如下：1、以TcLr24为材料，分别于接菌后0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、96h剪取叶片，提取各时间点的总RNA，等量

5、混合后纯化mRNA作为反转录模板。用In．FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit构建了不同时间点混合的TcLr24叶片的cDNA文库。文库包含2．1×106个单克隆，插入片段介于在O．5．1．5kb之间，平均插入片段大小为1．0kb。随机挑取30个克隆进行测序，经比对发现与ATP结合蛋白、细胞周期T1家族蛋白、纤维鞘CABYR结合蛋白、生长素转运蛋白和组蛋白去乙酰化酶HDAC3等相关的EST序列。2、以前期研究利用RNA指纹图谱技术获得的在TcLr24和That

6、cher与小麦叶锈菌互作时的差异表达片段R27和3'RACE序列为靶序列，提取TcLr24的总RNA并反转录成cDNA，设计5'RACE扩增引物，应用Touchdown程序从eDNA模板中扩增得到750bp的目的片段，经回收测序，成功与靶序列拼接，得到cDNA1475bp全长基因序列。根据开放阅读框两侧设计全长基因引物，分别在TcLr24gDNA和cDNA中获得1048bp和1816bp的条带并测序。基因结构分析发现，该基因含4个内含子和5个外显子。该基因包含1038bp的开放阅读框，编码345个蛋白质氨基酸序列，221bp的

7、5’非翻译区，216bp的3’非翻译区和29bp的多聚腺苷酸尾，该基因编码产物具有GMP合成酶、天冬酰胺合酶等结构域。进化树分析表明：该基因与山羊草和大麦亲缘关系较近，与高粱亲缘关系较远。该蛋白的分子量是38．64kDa，是亲水性蛋白。小麦染色体缺体四体定位将该基因定位于1B染色体。3、将GMP合成酶基因的ORF插入到pGEM．TeasyVector克隆载体中，获得的重组质粒R27．T经BamHI和XhoI双酶切，将回收的酶切片段定向插入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pET-28a(+)中，获得原核表达载体R27．pE

8、T-28a，把正确序列的重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)中，表达出的融合蛋白分子量大小为38kDa左右。关键词：小麦叶锈病、TcLr24、eDNA文库、GMP基因克隆、原核表达万方数据cDNALibraryConstructionofTcLr24in