atoh7调控视网膜mü ller细胞向神经节细胞定向分化的机制研究

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1、万方数据中图分类号UDC77，610博士学位论文学校代码密级10533公珏Atoh7调控视网膜MulIer细胞向神经节细胞定向分化的机制研究Atoh7promOtesthemechanismofdifferentiationofMiillercellsintoretinalganglionceIls作者姓名：宋伟涛学科专业：临床医学研究方向：眼科学学院(系、所)：湘雅医院指导教师：夏晓波教授论文答辩日期婴!生』．；】答辩委员会主席碰》中南大学二。一四年五月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论

2、文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：弛日期：丝丘年工月盟日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子

3、版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：兰竺迭导师签万方数据博士学位论文中文摘要第一章视网膜Miiller细胞的纯化培养及去分化诱导目的：分离和纯化培养视网膜Mnller细胞及去分化诱导并鉴定。方法：取出生10．21天SD大鼠，显微镜下分离视网膜，采用反复不完全胰酶消化法传代培养。取第三代视网膜Mnller细胞行荧光激活流式细胞分选仪(FACS)、免疫荧光细胞化学染色

4、及RT．PCR检测，确定视网膜Mnller细胞的纯度。取第三代视网膜Mnller细胞，在去分化培养基(含l×N2，2×B27，20ng／mlEGF，10ng／m1bFGF)中培养，诱导去分化。显微镜下观察细胞的增殖状态，免疫荧光细胞化学、RT．PCR、Westem-blot检测视网膜干细胞特异性标记物Ki．67和Nestin的表达；Edu染色检测细胞增殖能力。结果：FACS检测视网膜Mnller细胞的纯度高达98．01％。荧光显微镜10倍下选取10个非重叠视野，计算表达GS的细胞阳性率，GS的细胞阳性表达率为

5、98．50％士1．08％。RT．PCR结果显示纯化后的细胞高表达视网膜Mtlller细胞特异性标记物(GS、Vimentin)，而视网膜中其他类型细胞的标记物无表达。去分化培养3—7天，细胞增殖聚集成球。免疫荧光细胞化学显示，神经球Nestin的阳性率为92．94％士6．48％，Ki．67的阳性率85．96％士6．04％；RT．PCR及Westem．blot显示，神经球高表达Ki．67和Nestin的mRNA及蛋白产物。Edu染色显示神经球内细胞核阳性率为82．80士6．65％，表明细胞具有活跃的增殖能力。结

6、论：采用反复不完全胰酶消化传代法可快速、高效获得高纯度的鼠视网膜Mnller细胞。纯化的视网膜Mnller细胞在去分化培养培养基中克隆增殖形成神经球，表明№11er细胞是一种潜在的视网膜干细胞来源。万方数据博士学位论文中文摘要第二章Atoh7体外调控视网膜Miiller细胞来源的千细胞向神经节细胞的定向分化目的：体外研究Atoh7对视网膜Mnller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化的调控作用。方法：体外纯化后视网膜Mnller细胞诱导去分化为视网膜干细胞；预实验确定感染复数(烈llt译lic姆ofinfl

7、ection，MOI)和感染效率。随机将视网膜干细胞分三组：PGC—FU—Atoh7．GFP慢病毒感染组，PGC—FU．GFP空载体感染组及未感染组。更换分化培养基(DⅧM但12，1n星r／mlBDNF，l“MRA，1％FBS)后按分组分别实施干预；倒置相差显微镜下每天观察感染后的视网膜干细胞。分别在7和14天采用免疫荧光细胞化学双标染色检测神经节细胞特异性标记物111y1．1和Bm．3b，并计算神经节细胞所占百分比；统计学软件采用SPSS13．0，选择one．wayANO、A和Studem’st．test进

8、行统计学分析，取P<0．05有统计学意义。R11-PCR和W色stem_blot检测干细胞向神经节细胞分化过程中Atoh7基因及其下游基因的表达。结果：感染复数为10，FACS检测感染效率为75．41％。分化7天后，免疫荧光细胞化学双标染色结果显示：PGC．FU．Atoh7．GFP慢病毒感染组中神经节细胞阳性率为50．40土8．22％，PGC．FU．GFP空载体组中神经节细胞阳性率为13．30士13