视网膜变性过程中Müller细胞通过mGluR5_8调控神经元重塑的机制研究

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1、视网膜变性过程中Müller细胞通过mGluR5/8调控神经元重塑的机制研究重庆大学博士学位论文学生姓名：戴加满指导教师：阴正勤教授专业：生物医学工程学科门类：工学重庆大学生物工程学院二O一七年十月MechanismofMüllerCells’RegulationofretinalRemodelingbymGluR5/8DuringRetinalDegenerationAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDoctor’sDegreeofEnginee

2、ringByDaiJiamanSupervisedbyProf.YinZhengQinSpecialty:BiomedicalEngineeringCollegeofBioengineeringofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaOctober,2017中文摘要摘要视网膜色素变性（Retinitispigmentosa，RP），是一组以光感受器进行性凋亡为特征的、不可逆的、严重的致盲性眼病。迄今为止，已发现逾200种突变基因与RP的发生相关，其发病率越为1:4000。RP变性过程中的视网膜重塑可以分为三个阶段：早期为光感受器细胞应激

3、反应期；变性中期以光感受器细胞凋亡，下级神经元重塑伴随胶质细胞活化、胶质化为主要特征；晚期为光感受器细胞基本消失、视网膜内层神经元重塑、胶质细胞形成胶质瘢痕。Müller细胞是视网膜内横跨视网膜各层，并与各级神经元保持功能紧密联系的最重要的胶质细胞。视网膜变性过程中Müller细胞重塑形成的胶质瘢痕，因其能够分割残留视网膜神经元与视网膜色素上皮、脉络膜之间的交流，所以会加剧视网膜神经元的变性，并成为干细胞移植、基因治疗、视觉假体移植等方式治疗视网膜变性疾病的严重阻碍。阐明视网膜变性过程中Müller细胞重塑的机制成为亟待解决的科学问题。Müller细胞胶质化的主要特征是

4、其胶质激活即胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein,GFAP）表达升高。启动Müller细胞的活化和胶质化的始动因素目前尚不清楚。如何降低Müller细胞胶质化、减少视网膜神经元的凋亡进而延缓视网膜变性的进程一直是研究的热点与难点。谷氨酸是光感受器释放的唯一的神经递质，也是唯一贯穿视网膜全层的神经递质。暗环境下光感受器细胞持续释放谷氨酸，释放到突触间隙的谷氨酸被位于下级神经元上的谷氨酸受体感受而进行信息传递，同时释放到突触间隙的谷氨酸必须被迅速的清除，以使得谷氨酸浓度在突触前和突触后维持在一定的浓度梯度，这样才能保持突触传递较高的信息

5、传递信噪比并避免兴奋性氨基酸堆积引起的兴奋性毒性导致神经元凋亡。Müller细胞可通过其膜上谷氨酸/天冬氨酸转运体（glutamate/asparatetransporter,GLAST）将谷氨酸转运进入胞内，通过谷氨酰氨合成酶（glutamatesynthetase,GS）将其转化为谷氨酰胺，再通过谷氨酰胺转运体（SN1/2）运送到胞外，进而为神经元吸收并利用，此过程被称为谷氨酸-谷氨酰胺循环（glu-glncycle）。既往研究指出正常视网膜中，光感受器细胞-双极细胞形成的突触间的谷氨酸主要是通过位于突触前膜上的谷氨酸转运体来完成清除，而Müller细胞主要负责视网

6、膜内层谷氨酸的代谢。是当选择性的失活Müller细胞后，视网膜光感受器功能则明显受损。同时，在视网膜变性早期，Müller细胞的谷氨酸代谢即出现异常，位于双极细胞上的代谢型谷氨酸受体6（metabotropicglutamatereceptor6，mGluR6）最早出现明显改变。因此，我们提出假设：视网膜变性过程中，谷氨酸及其代谢型受体功能的异常是触发Müller细胞重塑的始动因素。I重庆大学博士学位论文针对以上假设，本文的研究内容和结果如下：一、Müller细胞调控mGluR5影响闪光视网膜电图（flashelectroretinogram,FERG）的a波幅值。正常

7、大鼠视网膜下腔注射GS的抑制剂，DL-AAA或者MSO，发现其能够降低反映视网膜光感受器功能的FERG的a波幅值；同时，通过免疫组化、免疫印迹（WesternBlotting,WB）和定量聚合酶链式反应（Quantitativereal-time,PCR）发现抑制GS后视网膜mGluR5会被激活；通过视网膜下腔注射mGluR5的激动剂（CHPG）和抑制剂（MPEP），证实mGluR5的活性改变可调控FERG的a波幅值，同时抑制GS后可上调反映光感受器细胞功能的标记物rhodopsin；接着，通过膜片钳技术发现mGluR5的激活可通过调控M