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时间:2019-03-02
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1、重庆医科大学博士学位论文MicroRNAs在Behcet病、Vogt--小柳原田综合征和Fuchs综合征中发病机制及易感性研究姓名:周庆芸申请学位级别:博士专业:眼科学指导教师:杨培增201205Micro砌悄s在Behcet病、V09t.小柳原田综合征和Fuchs综合征中发病机制及易感性研究毋中文摘要背景葡萄膜炎是一类由感染因素、免疫反应等引起的眼内脉络膜组织的炎症,好发生于青壮年,易反复发作,是常见的致盲眼病之一,也被称为眼内炎症。目前葡萄膜炎的临床类型和病因多达loo余种,而其中,Behcet病、Vo舀-/J、柳原田综合征这两类疾病为我国致盲率最高的葡萄膜炎类型,而Fuchs
2、综合征这类疾病则是一种致盲率低的葡萄膜炎类型。Behcet病、Vo或一小柳原田综合征目前普遍被认为主要是由自身免疫反应所介导的疾病,而Fuchs综合征目前报道显示与病毒感染相关。microRNA(微小RNA,miI姒A)是一类保守的小分子非编码RNA。miI矾A能与特异性的信使RNAs(mRNAs)的3’端非翻译区(un仃anslatedregion,UTR)互补结合,从而在转录后水平调控靶基因的表达,降解靶基因或者抑制转录后的翻译。目前研究显示miRNAs在免疫功能和自身免疫的调节以及病毒感染中发挥着关键的作用。本研究正是基于上述背景,进行了以下两大方面的实验:1。探讨本研究受以
3、下基金项目资助:1.国家自然科学基金重点资助项目(No.81130019);2.高等学校博士学科点专项科研基金(No.201155031100022);3.重庆医科大学优秀博士生课题资助项目(2010年)7二五种免疫相关的microRNAs在Behcet病和Vo醇一小柳原田综合征这两类自身免疫性疾病中的作用机制;2.探讨rIliR_146a和转录因子Ets—l基因多态是否与中国汉族人群Behcet病(BD)、VO舀.小柳原田综合征(VKH)和Fuchs’综合征(FUS)相关。通过上述研究,以期能对葡萄膜炎的发病机制有一个更深入的认识,同时为其防治寻找新的靶点。第一部分MiRNAs在
4、Behcet病发病中作用目的:microRNAs(miRNAs)在免疫调节和哺乳动物免疫应答反应中发挥着重要调控作用。在本文中,我们研究了microRNAs在Behcet病和Vo昏.小柳原田综合征这两类自身免疫性疾病中的作用机制。方法:1.分别抽取活动期、静止期的Behcet病、VKH综合征患者和正常人外周静脉血,并分离这些患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)、CD4+T细胞和树突状细胞(DC)。2.抽提细胞总RNA,运用TaqM锄定量PCR的方法检测外周血单个核细胞(PBMC)、CD4+T细胞和DC中五种与免疫相关的microRNAs的表达水平。3.体外用miRNA.155m
5、imics和miRNA.155inllibitor分别转染DC,运用流式细胞仪检测转染后的DC与成熟度相关的表面分子标记物(CD80,CD40,CD83,CD86和HLA—DR)的表达水平。4.采用ELISA方法检测转染后的DC分泌的细胞因子IL一6、IL—lO、IFN.Y和IL.1p的表达水平。5.体外共培养转染后的DC和CD4+T细胞,运用流式细胞仪检测CD4+T细胞内的细胞因子IL一17的表达水平6.运用miI埘A数据库预测miRNA.155的靶基因,再运用双荧光素酶报告基因的检测方法验证111iI埘A.155对预测的靶基因的3’UTR区域的荧光素酶抑制作用,最后用Weste
6、mBlot的方法进一步确认miIWA.155对靶基因的调控作用。结果:1.活动期Behcet病患者的PBMC和DC中miRNA一155的表达水平显著低于正常人,而活动期VKH患者的PBMC、活动期Behcet病患者的CD4+T细胞以及静止期Behcet病患者的PBMC和DC中这五种miIⅢAs水平与正常人相比均没有统计学差异。2.体外能成功将miIⅢA。155mimic及miIⅢA.155inhibitor转染入DC中,并且转染了miRNA一155mimic及miI斟A.155i1111ibitor的DC能分别高表达和低表达皿RNA一155。3.转染miRNA.155mimic及m
7、iRNA.155inhibitor后的DC,其成熟度没有统计学差异。4.转染miRNA—155mimics后的DC分泌的促炎因子IL一6呈现显著低表达,而抑炎因子IL一10、IL-1p则呈现显著高表达;而转染4重庆医科大学博士研究生学位论文miIⅢA.155inhibitor后的DC分泌的促炎因子IL一6呈现显著高表达,而抑炎因子IL.10、IL一1D则呈现显著低表达。5.转染了miI埘A一155mimics的DC共培养的CD4+T细胞中,炎症因子IL.17显著低表达
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