一.两型tnf-α正向信号与脂筏关系探讨%3b二.tnfr1及其突变体重组质粒的构建和ptriex4.0载体多克隆位点改造以及三聚体突变体的构建

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1、华中科技大学硕士学位论文英文缩略词表BpbasepairHhourLliterU`unitLBluria-BertanimgmiligramminminutekDkilo-daltonBSAbovineserumalbumincDNAcomplementaryDNADEPCdiethylpyrocarbonateDMSOdimethylsulfoxideDIO3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine,perchlorateDTTdiethiothreitolEDTAethylenediamineteraaceticacidGFPgreenfluo

2、rescentproteinICAM-1intercellularadhesionmoleculeFCMflowcytometryIkB-αinhibitorofnuclearfactorkappaB-alphaMCDmethyl-beta-cyclodextrinMCSmultiplecloningsiteODopticaldensityPAGEpolyacrylamidgelelectrophoresisPBSphosphatebufferedsalinePCRpolymerasechainreactionPMSFpheylmethylsulfonylfluori

3、deRpmroundperminuteRT-PCRreversetranscriptionpolymerasechainreactionSDSsodiumdodecylsulfate1华中科技大学硕士学位论文sTNF-αsecretedtumornecrosisfactor-alphaTEMEDn,n,n',n'-tetramethylethylenediaminetmTNF-αtransmembranetumornecrosisfactor-alphaTNFRtumornecrosisfactorreceptorTRAF2tumornecrosisfactorrec

4、eptorassociatedfactor2ChOxcholesteroloxygenoxidoreductase2独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件

5、和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文第一部分两型TNF-α的正向信号与脂筏的关系探讨中文摘要脂筏是存在于细胞生物膜上的特殊微区，富含胆固醇、鞘脂等脂质，并负载着相关蛋白，如GPI锚定蛋白、小窝蛋白(caveolin)等。它是一种动态结构，漂浮在无序的细胞膜脂质双层中。由于其特殊

6、的生化组成和特性，脂筏被认为是细胞膜上多种生物学活动活跃进行的结构域，其为蛋白质的相互作用提供募集平台，在信号转导、细胞骨架重建等过程中都发挥着重要的作用。TNF-α首先以跨膜的形式（tmTNF-α）表达在细胞表面，经TNF转化酶的作用，被剪切释放出分泌型TNF-α(sTNF-α)，两型TNF-α的作用不尽相同。前期工作提示tmTNF-α的-47位半胱氨酸是棕榈酰基化位点，tmTNF-α部分定位在脂筏内，但tmTNF-α介导的胞毒效应与脂筏的关系尚不清楚。此外，TNFR1也有部分定位在脂筏内，sTNF-α与脂筏内外的TNFR1结合，传递的信号是否一致也尚不清楚。为明确

7、两型TNF-α与脂筏的关系，从利用蔗糖密度梯度离心法提取脂筏结构和用脂筏破坏剂破坏完整的脂筏结构两方面入手，研究脂筏在两型TNF-α介导的正向信号中的作用。其主要结果如下：1.破坏靶细胞的脂筏可增强sTNF-α介导的杀伤，却抑制tmTNF-α的胞毒效应：本课题组前期实验中，以脂筏破坏剂MCD破坏HeLa细胞（靶细胞）的脂筏，可显著增强sTNF-α的胞毒效应（p<0.01），却明显抑制tmTNF-α的杀伤作用（p<0.05）。为了进一步说明两型TNF-α作用的变化是脂筏引起的，而不是MCD本身的影响，我们用另一种脂筏破坏剂胆固醇氧化酶（choleste