甘蓝esrk重组体、突变体的构建及其与scr相互作用单倍型的研究

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1、西南大学博士学位论文甘蓝eSRK重组体、突变体的构建及其与SCR相互作用单倍型的研究姓名：韦静宜申请学位级别：博士专业：蔬菜学指导教师：王小佳20120604甘蓝esRK重组体、突变体的构建及其与scR相互作甭覃甭型的研究蔬菜学博士研究生韦静宜指导教师王小佳摘要白交不亲和(Scl仁iIlcompatibil妨，s：)是显花植物在自然选择下进化出的反自交机制，而自交不亲和信号传导题耕究植物胞间信号传导的模式系统。sI反应在十字花科中表现为自我或自我相关的花粉在柱头表面的萌发抑制。这个反应是由发生在柱头表面的受体-配体相互作

2、用所激发的。该受体是一种跨膜的丝氨酸／苏氨酸受体激酶称为S．位点受体激酶(S．10cusreceptorkinase，SRK)。SRK位于覆盖整个柱头表面的细胞膜乳突纽胞中。SIⅨ胞外域(eSRK)主要是负责配体结合，在单倍型间呈现高度多态性，是个S特异性决定因子。SRK配体被称为S位点富含半胱氨酸(Sc)，ste逾e．rich，SCR)，或者SPll，位于富含脂质的花粉壁中，是一个富含半胱氨酸的小分子蛋白质。2001年＆曲roo等人的研究表明，SCR与SRK单倍型特异性结合导致自我花粉被拒绝。迄今为止，还没有实验研究出

3、sRK的单倍型特异性的决定因素，生物信息学的预测为这一命题带了各种各样的假说。eSRK(SRK胞外域)负责配体结合，根据序列相似度可以将esRK分成三个子域。N．端类似于甘露糖结合凝集素(B．Le鲥onDomain)，中间的高变区包含了与单倍型特异性相关的大量变异，c．端是相似最高的PAN或APPLE域，参与蛋白质一蛋白质或蛋白质．碳水化合物的相互作用。研究人员最感兴趣的就是高变区，目前已确定有三个高变区(HVI的，HVII和HVIII)，这些区域被认为是平衡选择的产物。据推测，高变区中一些多态氨基酸是在自然选择和植物理

4、化性质发生改变的情况下获得，这或许可以解释新S单倍型是如何演变而来。序列分析表明，SCR就是结合在SRK高变区上。在育种实践中，自交不亲和系已经成为重要育种材料，因此开展自交不亲和性相关研究具有重要的理论价值和现实意义。为探索eSRK序列上参与配体结合及相互作用的区域，我们以结球甘蓝高代自交系E、F为材料，构建了3个甘蓝不同单倍型的eSRK基因重组体，利用酵母双杂交系统检测各个重组体与SCR的相互作用。我们进一步分析了SRK高变区上的多态性位点，筛选出9个多态性较高的位点，对其进行突变，希望获得在s砌osCR单倍型特异性

5、相互作用中起决定作用的氨基酸位点。l植物材料自交不亲和性的分析为了鉴定本试验所使用的植物材料一结球甘蓝材料E、F的自交不亲和性，我们采用荧光显微法观察了两种材料花期自交及杂交后花粉管萌发情况，并测定了二者花期自交和杂交的亲和指数。结果显示，结球甘蓝材料E在花期自交时仅有少数(<10条)甚至没有花粉管进入柱头，说明结球甘蓝材料E具有自交不亲和特性。同样的，结球甘蓝材料F在授上自身的花粉后，在柱头中只能观察到少数(<10条)进入柱头组织中的花粉管。结球甘蓝材料E的花期自交亲和指数为O．23，F花期自交亲和指数为O．19，与多

6、年来的统计数据(未列出)相一致。通过荧光显微可观察到E、F花期相互杂交后柱头中有大量(>25)的花粉管，二者花期正反交的亲和指数均大于5。表明结球甘蓝材料E、F为强自交不亲和系，并且杂交亲和。2甘蓝材料舢和．譬C欠基因的克隆及分析针对P舒ⅨN端和C端相对保守的序列设计特异性引物eSRKs和eS砌

7、守的半胱氨酸、B．1ecthl、S．10c邺glycop以及PAN．APPLE区域等SRK胞外域绝大部分区域，除了信号肽。根据所获得的单倍型信息设计了克隆．蚴基因的引物，并顺利从结球甘蓝材料E、F花蕾gDNA中扩增出分别与e舒嗡、麟同源的SCR基因，命名为．妃‰和瓣。所获得的溉基因编码53个氨基酸，SC魅编码61个氨基酸，两段氨基酸序列均包含了SCR成熟肽的全部氨基酸序列，其中包含了在所有SCR氨基酸序列中高度保守的1个甘氨酸和8个半胱氨酸。3甘蓝eSRK中决定其单倍型特异性的肽段的研究3．1酵母双杂交系统检测SCR与各

8、个eSRK间的相互作用为了探讨HVI／II区域在SRK单倍型特异性及其与scR互作中的作用，本研究采用重组技术构建甘蓝不同单倍型丛砌@Z赋E与蚴基因间的重组体：P．S!R磁J、P．S!R磁2和e职‰，，用酵母双杂交系统3检测各eSRK重组体与SCR之间的相互作用。结果显示，pGBKT7一SCRE×pGADT7-eS砌