亚洲带绦虫六钩蚴ta18基因的克隆、表达及其芽孢益生菌型饲料添加剂的初步研制

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1、贵阳医学院硕士学位论文《中国图书资料分类法》分类号：R384单位代码：10660学号：S090034贵阳医学院2012届硕士学位论文亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因的克隆、表达及其芽孢益生菌型饲料添加剂的初步研制研究生：王宇导师：黄江教授年级：2009级专业：病原生物学2012年5月25日贵阳医学院硕士学位论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„1前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„3材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„6结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„27讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„41参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„45

2、英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„49主要英文缩写词„„„„„„„„„„„„„„52致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„53学位论文独创性声明„„„„„„„„„„„„„54综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„55附录„„„„„„„„„„„„„„„„„„64贵阳医学院硕士学位论文亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因的克隆、表达及其枯草芽孢益生菌型饲料添加剂的初步研制专业：病原生物学研究生：王宇导师：黄江教授【摘要】目的从亚洲带绦虫（Taeniaasiatica）六钩蚴cDNA文库中克隆出Ta18基因（亚洲带绦虫六钩蚴18kDa基因），分析预测其编码蛋白的结构和生

3、物学功能，对其进行克隆表达、免疫学特性分析，构建重组Ta18枯草芽孢工程菌并对枯草芽孢益生菌型饲料添加剂进行初步研制。方法用RT-PCR方法从亚洲带绦虫六钩蚴cDNA中获取Ta18基因，通过测序获得目的基因序列，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASy）中有关的生物信息学分析工具，结合其它生物信息学分析软件包，预测、分析基因编码的蛋白质的结构与生物学功能。将Ta18基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠杆菌BL-21/DE3中诱导表达，表达产物经纯化后用以免疫SD大鼠制备免疫血清。用蛋白印迹（West

4、ernBlotting）方法初步分析纯化的重组蛋白的免疫学特性。用RT-PCR方法从亚洲带绦虫虫卵、成虫不同部位的cDNA中检测Ta18基因的表达情况。使用枯草芽孢外壳主要成分CotC作为融合蛋白启动子，构建Pus186-CotC-Ta18融合表达质粒，转化入枯草杆菌WB600。使用DSM(DifcoSporulationMedium)培养基诱导芽孢生成，36h后收集芽孢。提取芽孢外壳蛋白。使用Ta18抗血清，蛋白印迹验证外源蛋白在重组芽孢表面的表达。结果成功克隆出Ta18基因，全长396bp，编码131个氨基酸，其序列包含完整开放阅读框，推导出的氨基酸序列与GenB

5、ank中牛带绦虫18kD蛋白的同源性最高，一致性达99%，与猪带绦虫一致性达97%。蛋白理化性质稳定，MotifScan分析显示Ta18含有纤连蛋白FnⅢ型结构域。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-Ta18构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得可溶性表达，经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别，具有免疫原性；同时重组蛋1贵阳医学院硕士学位论文白也能被亚洲带绦虫病患者、猪带绦虫患者和牛带绦虫患者血清识别，具有较好的免疫反应性。研究还发现Ta18基因在亚洲带绦虫成虫的头节、成节

6、、孕节中都有表达。成功构建了Pus186-CotC-Ta18融合表达质粒并转化入枯草杆菌WB600，DSM培养基培养36h诱导芽孢生成，提取芽孢外壳蛋白行15%SDS-PAGE，结果表明目的基因在芽孢表面高效表达，芽孢外壳蛋白能被重组蛋白Ta18免疫的SD大鼠血清识别，具有免疫原性。结论成功克隆出亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因。Ta18蛋白具有较好的免疫原性，并与其他绦虫的感染血清存在着交叉反应。该基因不仅在六钩蚴阶段表达，在成虫各部位也同时存在一定的表达。使用枯草杆菌芽孢作为疫苗的载体，疫苗候选分子Ta18能在其表面表达并具有免疫原性，为饲料添加剂的研制提供了理论基础

7、。【关键词】亚洲带绦虫；Ta18；克隆表达；免疫学特性；枯草杆菌2贵阳医学院硕士学位论文前言带绦虫是常见的人兽共患寄生虫，包括亲缘关系非常近的猪带绦虫（TaeniasoliumLinnaeus，1758）、牛带绦虫（TaeniasaginaiaGoeze，1782）和亚洲带绦虫（Taeniaasiatica）三种类型。人是这三种带绦虫唯一的终宿主，牛和猪是其主要的中间宿主，猪带绦虫（Taeniasolium）感染人也可引起后果严重的囊尾蚴病（囊虫病）。我国北部和西部地区是带绦虫病和囊虫病较严重的流行[1-3]区，尤以滇、黔、桂、川、藏、蒙为甚。研究证