deltex-1基因在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中的作用及其机制研究

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1、第三军医大学硕士学位论文Deltex--1基因在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中的作用及其机制研究姓名：王荥申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：徐惠成201205第三军医大学硕士学位论文Deltex一1基因在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中的作用及其机制研究水摘要研究背景与目的压力性尿失禁(stressurinaryincontinence，sui)是指膀胱无自主收缩情况下腹压突然增高导致尿液不自主流出，也称真性压力性尿失禁、张力性尿失禁、应力性尿失禁，其特点是正常状态下无遗尿，而腹压增高时尿液不自主流出。主要表现为咳嗽或剧烈运动后出现尿液自尿道外口不自主漏出[1,21，为女性常

2、见病，其患病率随年龄增长而增高，严重影响女性生活质量。SUI的关键机制是膀胱颈支撑功能障碍与尿道固有括约肌缺陷(intrinsicsphincterdeficiency，ISD)。而ISD主要由尿道周围平滑肌细胞(smoothmusclecell，SMC)病变或凋亡所致【3】。目前SUI的治疗方法众多，但均不能从本质上恢复尿道括约肌功能。近年来，成体干细胞的移植已成为再生医学的重要手段【41，为压力性尿失禁的治疗提供了新的策略。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，bMSCs)具有自我更新和多向分化潜能，经诱导后在体外可分化为多种细胞，尤其如SMC

3、。bMSCs取材方便，可直接由骨髓提取，提取后增长速度较快，可自体移植。同时，由于bMSCs具有诱导多向分化性和表观修饰后能表达特定外源目的基因等特性，将其用作种子细胞，用于基因及细胞治疗的前期研究，已成为当下热点。但值得我们关注的是体外诱导bMSCs向SMC分化的数量及功能均难以达到治疗SUI的目的。因而，研究其作用机制成为我们研究的重点和方向。MSCs多向分化能力可能涉及多种不同的机制，主要包括三个方面，转录因子随机抑制或激活、微环境诱导分化及信号转导通路的调控作用。现越来越多的研究者发现信号转导通路在干细胞分化中发挥着重要的作用。目前的研究已经揭示了调控干细胞命运的三大信号：Notc

4、h、Wnt和Shha。其中Notch家族是由高度保守的蛋白质组成，是细胞间实现通讯的重要信号分子。该家族具有受体和基因调节转录的功能，可通过细胞间信息的相互传递使胞内蛋白之间作用而实现信号的调控。其配体为膜蛋白，脊椎动物体内存在多个Notch配体，其中与Deltex同源的称为Deltex或Deltex—like。在+本研究获国家自然科学基金资助项目(30772309)研究经费资助。8第三军医大学硕士学位论文哺乳动物体内，Deltex家族包括deltex．1，Deltex．2，Deltex一3，Deltex一4成员。Deltex一1作为Notch信号通路的下游分子，可增强或抑制Notch信号

5、表达【8】，可通过调控Notch通路以调节淋巴前体细胞、调节神经前体细胞的分化等。Deltex一1蛋白在结构上高度保守，包括三个结构域，DomainI，DomainII和DomainlII。DomainI是Deltex．1功能的必须部位，与Notch胞内段ANK重复结构结合，以调节Notch信号[91；DomainII为脯氨酸聚集区，与SH3结合，主要调节蛋白与蛋白或蛋白与脂类问的相互作用；DomainlII与Deltex—l的降解有关。研究表明，Notch通路的激活可促进bMSCs向SMC分化【5。6】。Notch信号通路可分为CSL非依赖及CSL依赖两种途径。Arias等【_7】在研究

6、Notch基因突变时在果蝇体内发现CSL非依赖途径，后于哺乳动物体外细胞实验中证实。随后的研究发现，Deltex蛋白在介导CSL非依赖的Notch通路中发挥了重要作用，但其作用机制暂不清楚。因此，本研究探讨bMSCs在SMC环境中deltex．1基因促进bMSCs向SMC分化的作用及其机制，为进一步研究采用经deltex一1基因修饰的bMSCs治疗女性压力性尿失禁奠定基础。方法本研究拟首先分离、培养与鉴定SD大鼠bMSCs，随后克隆Deltex一1基因，构建其腺病毒载体pAd／Deltex一1，并以此腺病毒载体感染大鼠bMSCs，观测Deltex．1基因对大鼠bMSCs增殖的影响。随后将经

7、Deltex．1基因修饰的bMSCs与SMC共培养，观测经Deltex一1基因修饰的bMSCs在SMC环境中的变化情况，以此探讨Deltex一1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制，具体如下。一、bMSCs的分离、培养及鉴定采用密度梯度离心法(percoll，1．0739／m1)分离SD大鼠bMSC，特异性免疫抗体标记结合流式细胞仪及进行成骨、成脂诱导对bMSC的纯度与干性予以鉴定。二、Deltex一1基因腺病毒