两种短命植物hrd转录因子基因的克隆与抗旱功能验证

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1、万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：节承殍时间：≯，＼p年占月喀日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存

2、、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)鬻：黪导师签名：忧仡衫时间：力，∞年占月房日时1日：训够年6只f3日万方数据IIIIIIIIIIIIIIIIIIIY2697885本文是转基因生物新品种培育科技重大专项“长江流域和西北内陆棉区耐旱、耐盐碱、抗病虫等转基因棉花新品种培育"(项目编号：2013ZX08005004一009)以及自治区产学研联合培养研究生示范基地项目“线果芥册基因的克隆与功能验证”(项目编号：xj

3、aucxy—yjs-20131018)的部分研究成果课题主持人：陈全家教授(新疆农业大学)万方数据两种短命植物脚转录因子基因的克隆与抗旱功能验证摘要干旱和腌渍严重制约着农作物的生产和发展，也是导致地球荒漠化的主要原因，对世界范围内的作物的生长带来了巨大的影响。新疆是农业大省，农业用水占总用水量的90％以上，而新疆水资源短缺，用于农业的水资源有限，因此利用基因工程手段发现和分离干旱生境中优质、高效天然的抗旱相关基因、研究抗旱机理以获得抗旱新品种，无论对新疆干旱区的生态恢复，还是对抗旱作物品种的选育均具有重大的意义。新疆地域辽阔，但是大部都被盐碱地占据，正因为有

4、干旱、盐渍和低温的非生物胁迫环境，才孕育出许多适应逆境的特色生物资源。线果芥(Conringiaplanisiliqll0L．)和大蒜芥(SisybriumaltissimumL．)就是在新疆大地上世代繁衍而生存下来的草本绿色植物，属十字花科类早春短命植物，对新疆的特殊环境表现出出色的适应性。为了进一步研究大蒜芥和线果芥在干旱胁迫下的响应机理，本研究用同源克隆的方法获得了大蒜芥和线果芥HRD基因，构建植物表达载体转入烟草，通过土壤干旱实验和PEG．6000模拟干旱实验来验证转基因烟草的抗旱性，结果证实了这个基因属于彳尸2倔IREBP类转录因子，具有AP2／E

5、REBP转录因子的基本特性，在转基因烟草中的过量表达可以提高烟草抵抗干旱的能力。主要研究结果如下：1．分别从新疆短命植物线果芥和大蒜芥中克隆得到了一条完整开放阅读框为564bp，编码187个氨基酸的HRD转录因子基因，命名为cpHea9和SaHRD。比对发现二者仅有3个位点氨基酸序列的差别，具有很高的同源性，应属于同源物种。与山嵛菜(Eutremasalsugineum)、琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)、荠菜(Capsellarubella)及拟南芥(Arabidopsisthaliana)核苷酸序列的同源性可达88％、87％、87％和86

6、％。2．生物信息学分析表明：CpHRD和SaHRD基因编码的蛋白质分子量约为20kDa，等电点分别为4．73、4．8l，属于含信号肽的亲水性非跨膜稳定蛋白。蛋白二级结构包括2个p一折叠、5个cc一螺旋和无规则卷曲，位于N端有2个反平行的B．折叠碱性亲水区。二者均只含有一个保守的AP2／EREBP功能结构域，位于第14—72氨基酸位点之间，据研究该结构域转录因子与植物的抗逆性密切相关。3．构建了CpHRD和SaHRD基因的植物表达载体，并分别导入到烟草中，获得了转基因材料。对两种转基因烟草进行了干旱胁迫实验，测定了相关的生理指标，结果显示两种转基因烟草的抗旱能

7、力均高于对照组，且转CpHRD基因烟草抗旱性优于转勋瑚D基因烟草。4．构建了CpHRD和SaHRD原核表达载体，对原核表达体系进行了优化，结果表明在25。C，0．05mmol／LIPTG浓度诱导4h时蛋白表达最佳。通过Westernblotting进行鉴定证明表达的蛋白正是His-HRD融合蛋白。关键词：短命植物；HRD转录因子；基因克隆；转基因烟草；抗旱性验证万方数据CloningandDroughtFunctionalVerificationofHRDTranscriptionFactorsGenefromTwoKindsofEphemeralAbSt阳

8、CtDroughtandpickledrestric