脐带源间充质干细胞在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的肝细胞样分化作用

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1、河北医科大学硕士学位论文脐带源间充质干细胞在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的肝细胞样分化作用姓名：张国尊申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张晓岚201203中文摘要脐带源问充质千细胞在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的肝细胞样分化作用摘要肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是肝脏对各种不同致病因子引起的慢性炎症、坏死或其他损伤的修复反应，肝硬化则是肝纤维化的终末阶段。此时，肝炎病毒、酒精代谢产物、胆汁酸等肝脏毒性物质作用于肝细胞，肝功能明显下降，同时受损肝细胞释放的AST、—螂、TBIL、DBIL、活性氧(reactiveoxyg

2、enspecies，ROS)和纤维形成介质导致自身凋亡。目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效方法，但由于肝源紧张、免疫排斥等原因限制了肝移植的临床应用。因此亟待寻找新的有效治疗方法。细胞治疗是指有活性的细胞替代、修复损伤的组织，进而使组织器官恢复其功能的有效治疗方法。近年来细胞治疗己成为替代器官移植的有效治疗方法。其中干细胞治疗肝硬化等终末期肝病的疗效已得到证实。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，广泛存在于骨髓、脐带组织、脐血、外周血及脂肪等组织中，在特定条

3、件下，可以分化为骨细胞、神经细胞、肝细胞等多种细胞。MSCs易于提取，低免疫原性，并且具有免疫抑制作用，避免了肝移植的肝源紧张、移植后免疫排斥等不足，被认为是目．前最具治疗潜力的供体细胞。有研究证实骨髓源间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BM．MSCs)可以分化为功能性肝细胞，修复损伤的肝组织，从而改善肝纤维化和肝硬化；另有研究发现脂肪源MSCs(adiposetissue．derivedmesenchymalstemcells。AT．MSCs)在体外向肝细胞分化过程中经历了间充质细胞向上皮细

4、胞的转变(mesenchymal．to．epithelialtransition，MET)。关于MSCs在体内的动态分化过程及在此分化过程中是否经历了MET尚不清楚。为此，我们构建大鼠肝纤维化及肝硬化模型，经尾静脉注射人脐带源MSCs(humanumbilicalcord．dedvedmesenchymalstemcells，hUC．MSCs)，观察hUC．MSCs对肝纤维化、肝硬化的治疗作用，在体内的动态分化过程及分化的具体机制，为hUC．MSCs治疗肝纤维化及肝硬化提供理论依据。中文摘要目的：研究hUC．MSCs在肝纤维化及肝硬化

5、大鼠体内的动态分化过程及其分化机制。方法：将健康成年雄性Wistar大鼠分为对照组(正常大鼠，CCldsaline0wk，8只)，模型组(肝纤维化模型组：cch／saline4wks，5wks，7wks；肝硬化模型组：CCldsaline8wks，10wks，14wks；每组8只)，MSCs移植组(肝纤维化MSCs移植组：CCldMSCs0wk，1wk，2wks，4wks；肝硬化MSCs移植组；CCl4／MSCs0wk，2wks，4wks，8wks；每组8只)。采用浓度40％CCl4橄榄油溶液，按2ml／kg体重的剂量，给予四肢轮流皮

6、下注射，每周2次；造模成功后模型组及治疗组继续每周2次皮下注射CCh，直至处死。肝纤维化及肝硬化MSCs移植组分别于造模成功后(即CCh注射第4周和第7周)经尾静脉注射hUC．MSCs，剂量为5X106个／只，并分别于注射后l、2、4周和2、4、8周处死大鼠。应用血清学检测方法检测大鼠舢_一T、AST、ALB、TBIL、DBIL，观察hUC-MSCs移植对大鼠肝功能的影响；采用Haematoxylinandeosinstaining(H&E染色)、Masson’S仃ichromestaining(MT染色)和天狼猩红染色法检测肝组织病

7、理改变；采用免疫荧光染色、Westernblot和real．timeQ．PCR方法检测各组大鼠肝脏组织中人来源的ALB、AFP蛋白和mRNA的表达，免疫组织化学染色、Westernblot和Realtime．PCR方法检测人来源的CKl8、CKl9、vimentin、a-catenin、E．cadherin蛋白和mRNA在大鼠肝组织中的表达，采用Realtime．PCR方法检测人来源的N．cadherin。结果：OH&E、MT及天狼猩红染色结果显示：CCl4诱导的大鼠肝纤维化和肝硬化模型成功建立，模型组随给药时间的延长，肝细胞变性坏死

8、及肝内纤维组织沉积逐渐增多；与模型组相比，MSCs移植组肝细胞变性坏死有所减少，HE炎症评分、纤维化程度分级及纤维组织沉积定量分析结果显示：与模型组相比，除肝纤维化MSCs移植CCldMSCslwk组与肝纤维化模型CCl