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《ap-2α对滋养细胞功能的影响及在重度子痫前期发病机制中作用的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofDoctorTheeffectofAP一20conbehaviouroftrophoblastandresearchofthepathogensisoftheseverePreeclampsiaByLingZhangSupervisor：Prof．ZhanZhangDept．ofClinicalLaboratoryDiagnosticsTheThirdAffiliatedHospitalMay2013 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月同学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月曰 中文摘要AP．2a对滋养细胞功能的影响及在重度子痫前期发病机制中作用的研究博士研究生：张玲导师：张展教授专业：临床检验诊断学郑州大学第三临床学院河南郑州：邮编450052重度子痫前期是妊娠期特有的疾病，是引起孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一。虽然近几年来关于它的研究有了更深的认识，但其确切的病因至今国内外尚未阐明。因此，对于重度子痫前期发病机制的进一步探讨，已经成为国内外学者关注的焦点。重度子痫前期的发病机制非常复杂，涉及到多种因素，目前普遍认为：孕早期胎盘浅着床和血管重塑障碍是重度予痫前期发病的中心环节。胎盘滋养细胞『F常分化、迁移、侵袭和凋亡是胚胎着床和胎盘形成的重要保障。一型．平衡失调，将导致孕早期胎盘滋养细胞发生过度凋亡，削弱了滋养细胞的侵袭力，从而引起胎盘形成和发育的畸形，这可能是重度子痫前期发病的关键因素。因此，本次课题研究以能影响滋养细胞侵袭及凋亡生物学行为的因素作为切入点，进一步探讨重度子痫前期的发病机制。转录因子激活蛋白．2d(AP．2a)是一个重要的转录因子，通过信号转导通路转录性调控其下游靶基因的表达，从而参与脊椎动物的生长发育过程；同时又因为AP．20【能影响肿瘤细胞的迁移、侵袭及细胞凋亡等功能，所以AP一2a与肿瘤的发生及发展也密切相关。SchwartZ等发现在晚期结肠癌细胞中，存在AP．2a表达缺失的现象，当采用AP。2a质粒转染结肠癌细胞系SW480时，发现SW480细胞中E．cadherin的表达增加，MMP．9的表达及活性降低，同时，也发现AP．2a能使结肠癌细胞侵袭性和致瘤性减弱的现象，这一研究结果表明， 中文摘要AP．2Gt是通过调节E．cadherin和MMP．9的表达，在结肠癌的发生及癌细胞远处转移的过程中起着重要的调控作用。胎盘滋养细胞类似于肿瘤细胞，也具有迁移及侵袭等特征，而其侵袭性主要依赖于大量的蛋白水解酶(如：MMP一2、MMP-9等)及细胞粘附分子(如E．cadherin)等，共同参与细胞外基质的降解而得以实现的。那么AP．2ct是否也能通过调控滋养细胞中MMP．9及E—cadherin的表达，而影响滋养细胞的侵袭力，从而可能参与子痫前期的发病呢?对这一观点的提出，目前国内外尚未见报道。越来越多的关于COPD和人乳腺癌等的研究发现，AP一20【能通过调节VEGF、P53、p21WAF／CIP、Bcl．2和MnSOD等的表达，进而参与调控细胞凋亡过程。多项研究也发现，Bcl．2和Bax异常表达与子痫前期中滋养细胞发生过度凋亡有关，那么滋养细胞中Bax和Bcl一2是否也受到AP-2a的直接转录性调控，从而诱导滋养细胞发生过度凋亡，对这一观点的提出，目前国内外也未见报道。本研究采用免疫组化及realtime．PCR的方法检测AP一2a与Bax、Bcl一2、MMP．9和E．cadherin在重度子痫前期胎盘组织中的表达，进而通过体外培养人绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞，分别瞬时转染及干扰BeWo细胞中AP一2a的表达，采用realtime．PCR及Westemblot的方法，从基因及蛋白水平分别检测AP．2(t下游靶基因Bax、Bcl一2、MMP．9和E．cadherin表达的变化；同时分别采用MTI"方法、Transwell方法及FCM方法检测AP．2a对BeWo细胞增殖、侵袭及凋亡作用的影响，进一步分析AP一20【是否通过直接转录性调控Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin的表达，而影n向滋养细胞的凋亡及侵袭力等生物学功能，从而说明AP．2a及Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin在重度子痫前期的发病机制中共同发挥重要的作用。第一部分：AP．2Q及相关靶基因在重度子痫前期胎盘组织中的表达目的本研究通过分析AP．2ct及靶基因Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin在重度子痫前期组胎盘组织与正常对照组胎盘组织中的定位和表达的变化，探讨AP．2a及其靶基因Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin在子痫前期发病机制中可能发挥Il 中文摘要的作用。方法采用免疫组化的方法，检测重度子痫前期组胎盘组织及正常对照组胎盘组织中，AP．2a及其靶基因E．cadherin、MMP．9、Bax和Bcl．2的定位及蛋白的相对表达；采用realtime．PCR方法，检测重度子痫前期组胎盘组织及『F常对照组胎盘组织中AP．2a及Bax、Bcl一2、MMP．9和E．cadherinmRNA的相对表达。曩士甲=日木1．免疫组化结果分析：(1)AP一2a、Bax、Bcl．2、MMP一9和E—cadherin蛋白在胎盘组织中，均表达于胎盘滋养细胞及绒毛外滋养细胞，其中AP．2a主要表达于细胞核，E—cadherin主要表达于细胞膜，MMP．9、Bax和Bcl。2主要表达于细胞膜及细胞浆。(2)重度子痫前期组胎盘组织中，AP．2a、Bax及E—cadherin的阳性表达明显高于正常对照组(P0．05)。两组孕妇孕周、BMI及胎儿体重比较‘，差异有统计学意义。重度子痫前期的诊断严格按照2002年美国妇产科学协会(AmericanCongressofObstetricsandGynecology，ACOG)和人民卫生出版社出版的乐杰主编的第七版《妇产科学》的诊断标准。两组均排除既往合并内外科疾病和其他产科并发症(如：前置胎盘、胎膜早破、胎盘早剥及妊娠期糖尿病等)。表1研究对象的临床资料4 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达1．2主要实验试剂和仪器1．2．1主要仪器．StepOnePlus荧光定量PCR仪美国ABI公司台式高速4。C冷冻离心机德国Eppendorf58公司9700Geneamp定量PCR仪美国ABI公司凝胶成像系统美国UVPGDS公司紫外分光光度计DU640美国BakerMan公司电子天平德国赛多利斯公司移液器德国Eppendorf公司MILLQ超纯水仪美国MillQ公司水浴锅上海医疗仪器厂一20℃冰箱日本三洋一80℃冰箱同本三洋4℃冰箱同本三洋光学显微镜同本OLYMPUSLeicaRM2135石蜡切片机美国Leica公司烤箱SC／303(浙江嘉兴)全自动电子恒温箱上海医用分析仪器厂台式电热恒温水槽上海医用分析仪器厂水平电泳系统DYY-7B北京六一仪器厂垂直电泳系统美国BioRad公司1．2．2主要试剂RNA提取试剂RNAZOL反转录试剂盒琼脂糖M．MLV逆转录酶d脚OligodTDI2000Marker5大连宝生物公司西班牙BIOWEST公司大连宝生物公司 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达TaqDNA聚合酶ROX(20X)DNAmarkerDNA琼脂糖凝胶回收试剂盒二氨基联苯胺(DAB)试剂盒SP免疫组化检测试剂盒鼠抗人AP．2a抗体鼠抗人Bcl．2抗体鼠抗人Bax抗体鼠抗人MMP．9抗体鼠抗人E—cadherin抗体鼠抗人Beta—Actin抗体大连宝生物公司上海生工生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司美国SantaCruz公司丹麦Dako公司美国SantaCruz公司1．2．3主要溶液的配制(1)磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCI42．59，NaH2P041．59，Na2HP04‘12HzO299，加去离子水至5000ml，PH值为7．3±0．1，高压灭菌，4。C保存。(2)抗原修复液：①0．1M的枸橼酸溶液：21．019枸橼酸(C6H807．H20)，溶于1000ml蒸馏水中。(3)4％PA多聚甲醛409，溶于PBS至1000ml，煮溶后冷却、过滤，加蒸馏水定容为1000ml。(4)DEPC水：用lmlDEPC加入1000ml双蒸水，从而配制为浓度1％o的DEPC水，室温存放。1．3实验方法1．3．1标本采集和处理行剖宫产术胎盘娩出后15分钟内，取胎盘母体面3、6、9、12点以及中心处，纵行贯穿胎盘取材，收集胎盘组织约lxlxlcm3大小的组织5块，避开出血、梗死及钙化区域。用预冷的PBS漂洗组织，去掉附着的血迹后，再用消毒的滤纸吸干液体，一部分胎盘组织立即放入冻存管并投入液氮，后转入一80。C冰箱保存，用于今后RNA提取，realtime．PCR检测；另一部分胎盘组织采用4％多聚6 第一部分：AP一2Q及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达甲醛固定，石蜡包埋，待病理学检测观察使用。1。3．2胎盘组织学检查(HE染色)(1)石蜡切片，烤片30min，二甲苯脱蜡，5minx2次，梯度酒精进行水化(依次为：100％、95％、80％币u75％的酒精)，最后切片置入水中，各步骤均为5min，PBS冲洗5minx3次；(2)切片置入苏木素中染色5min，然后蒸馏水冲洗lmin，1％盐酸酒精分化1．2s，最后蒸馏水冲洗，(3)室温下显色为蓝色，伊红复染胞浆2-3min，蒸馏水再次冲洗5min；(4)梯度酒精脱水(浓度从低至高：75％、80％、95％、100％酒精脱水各5min)；(5)二甲苯透明5minx2次，中性树胶封片。1．3．3胎盘组织免疫组织化学分析1．3．3．1免疫组织化学方法对各组胎盘组织中AP一2a、Bax、Bcl一2、MMP．9和E．cadherin蛋白的表达进行定位和半定量分析4％多聚甲醛固定的胎盘组织，依次经过梯度酒精和二甲苯脱水后，进行石蜡包埋，连续切片，胎盘组织切片厚度为4pm。应用免疫组化法(SP)分析，具体步骤如下：1．组织切片在二甲苯I中脱蜡10min；2．组织切片在二甲苯II中脱蜡10min；3．组织切片置于100％乙醇I中5min；4．组织切片置于100％乙醇II中5min；5．组织切片置于95％乙醇中5min；6．组织切片置于90％乙醇中5min；7．组织切片置于80％乙醇中5min；8．组织切片置于75％乙醇I中5min；9．将组织切片浸入抗原修复液，微波依次中温3min，中低温5min，低温5min，取出自然冷却；10．组织切片用蒸馏水洗涤5minx3次；7 第一部分：AP-2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达11．每张组织切片滴加3％H202灭活内源性酶，置湿盒里30min；12．蒸馏水冲洗组织切片5min×2次；‘13．组织切片在PBS中冲洗5min×3次；14．在组织切片上滴加血清封闭液，湿盒里室温孵育30min；15．倾去血清，滴加一抗(以PBS代替一抗为阴性对照)，置4。C过夜；16．从冰箱里取出组织切片，室温下置30min后，PBS冲洗5min×3次；17．在组织切片上滴加二抗，37℃湿盒里9呼育30min；18．组织切片用PBS冲洗5min×3次；19．滴加辣根酶标记的链霉卵白素，湿盒里37℃孵育10min；20．PBS冲洗5min×4次，并置室温30min；21．DAB显色：镜下控制显色时间，清水终止反应，蒸馏水洗涤；22．苏木素复染2min后，盐酸乙醇分化；23．脱水，透明，封片。步骤如下：组织切片依次经过75％乙醇5min、80％乙醇5min、90％乙醇5min、100％乙醇115min、100％醇I中5min；二甲苯II5min、二甲苯I5min，中性树胶封片，晾干。显微镜下观察。1．3．3．2胎盘组织半定量免疫组化结果判定标准以PBS替代一抗作为阴性对照，以细胞核、胞浆和(或)细胞膜中，出现棕黄色颗粒为阳性结果。镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞。根据细胞染色强度分3个等级：0分为无着色；1分为浅黄色；2分为棕黄色；3分为深棕色。染色结果的判断，采用免疫组化公式计算，即：HSCORE=∑pi(1+i)，pi代表阳性细胞所占的百分比，i代表染色强度。每张切片的免疫染色强度分别由两位病理学专家独立判断。1．3．4realtime．PCR测定各组胎盘组织中AP．2a、Bax、Bcl．2、MMP．9和E．eadherinmRNA的差异性表达1．3．4．1总RNA的提取和纯化胎盘组织总RNA按照TRIzol试剂说明提取，具体操作如下：(1)从．80。C冰箱中取出100mg胎盘组织，用研磨杵冰上快速研磨，并放置8 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达入1．5mlEP管中，向其内加入lmlTrizol，反复吹打，直至胎盘组织均匀浑浊；(2)室温震荡15sec，静止5min；(3)加入0．2ml的氯仿，用力震荡均匀，室温放置10rain；(4)4。C，12000rpm，离心15min；(5)取上层含RNA的水相移入新的1．5mlEP管中(一般上层液大约600rtl)；(6)向其中加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，震荡15s，4。C离心12000rpm，15min；(7)可以观察到，胎盘总RNA在EP管底形成白色沉淀，弃去上清液，用小枪头吸尽乙醇，尽量吸干净，加入预冷的75％乙醇lml(用DEPC水配制)，小心洗涤RNA沉淀，将沉淀悬浮，4。C，7500rpm离心10min；(8)弃去上清液，室温干燥至半透明状态，加入609l1％o的DEPC水溶解RNA；RNA样品不用时．80℃冰箱冻存备用。1．3．4．2总RNA测定(1)提取RNA完整性的检测：提取的胎盘组织RNA样品，用1％乙醇变性的琼脂糖凝胶电泳法测定，紫外灯下分别观察28s、18s及5s三条RNA条带。若18s：28s=1：2，提示DNA污染少，如果出现5s条带明显，提示RNA存在降解，若18s：28s>1：2，则提示RNA部分已经降解。(2)提取RNA浓度的检测：取1¨l提取的胎盘组织RNA原液，用，DEPC水稀释到501．tl置于EP管中，混匀，用DEPC水作为空白对照，置于紫外线分光光度仪260nm和280nm处测吸光光度计(A)值，根据两者的比值(A260／A280)在1．8～2．0之间，来进行评估胎盘组织RNA的纯度。1．3．4．3cDNA的合成即：逆转录反应反应体系及反应条件如下：模板RNA溶液10mOligo(dT)引物29l以上70℃，10min，冰上冷却2min；上述RNA溶液129l5xRTbuffer41al9 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达dNTP1p1RNaseInhibitor0．5}tlRNaseM—MLVl1．tlRnasefreedH201．5pl以上总体积为20I，tl，40。C保温1h，置于70。C温育15min，使AMV反转录酶失活，冰上冷却即逆转录为cDNA。逆转录结束后的样品，一20。C冻存，待PCR检测时再取出。1．3．4．4实时荧光定量聚合酶链反应(realtimepolymerasechainreaction，real-timePCR)1)引物及探针的设计与合成AP一2仅、Bcl一2、Bax、E—cadherin及MMP一9引物及探针，采用Prime6．0软件设计，用GeneBlast进行同源检索后，由上海生工生物技术公司合成，以13-actin作为内参照。具体序列如下：10 第一部分：AP一2Q及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达2)real．timePCR反应(1)标准品制备：取AP．2a、Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin及13-actin样品为模板，PCR扩增。根据上下游引物浓度值，加水调整使它们的浓度差<10％，使用后的引物．20℃保存。(2)反应体系：10xTaqBufferlpldNTPsmixlpl10xPCR缓冲液(含Mgcl2)2．5plTaqDNApolymerase0．5plcDNAtemplatesl1．tl上游引物11．tl下游引物11．ddH2017pl总体积25pl(3)PCR反应条件：95。C预变性3min，95℃变性30S，、65℃退火30S，■共40个循环72℃延伸1minJ3)琼脂糖凝胶DNA电泳：取扩增后的PCR产物101上1，在含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶电泳，IOOV，30min。以DNAmarker为标尺，紫外灯下观察目的条带，用尖刀片切下目的条带，胶回收备用。1．3．4．5采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物具体步骤如下：1)切下目的片段的胶块，称重后(按lmg=lpJ，计算凝胶体积)；放入1．5ml 第一部分：AP-2Q及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达EP管里；2)加入BufferB2，50℃水浴10min；3)加入1／3BufferB2体积的异丙醇(约1331a1)；4)将溶胶液移入吸附柱中，8,000xg离心30s，倒掉收集管中液体；5)加入500plWashSolution(己加入乙醇)，9,000xg离心30s，倒掉收集管中液体；6)重复步骤5一次；7)将空吸附柱于9,000xg，离心lmin；8)将吸附柱放入一个干净的1．5ml离心管中，在吸附膜中央加入501al超净水，室温静置lmin后，离心lmin，即回收到产物。1．3．4．6制备realtime—PCR标准曲线取稀释为109．104拷贝／ltxl的各个目的基因模板及[3-actin内参基因模板各1LLl，得到它们的标准品扩增曲线，以模板起始拷贝数的常用对数作为横坐标，循环阈值作为纵坐标，即得到标准曲线，线性相关系数r=0．9997，表示定量准确。具体步骤如下：1)取lpl模板，按1010拷贝／lpl的浓度加入去离子水，混匀。将标准品依次稀释10倍，制成109、108、107、106、105、104浓度的梯度；2)取出loftl@+90pl去离子水⋯⋯即109／¨l；3)取出109l@+90pl去离子水⋯⋯即108／“l；4)取出10pl@+901al去离子水⋯⋯即10。7／“l；5)取出109l@+90}tl去离子水⋯⋯即106／gl；6)取出101．tl@+909l去离子水⋯⋯即105／“l；7)取出101．tl@+901xl去离子水⋯⋯即104／I．tl；标准品及样品反应体系如下：模板上游引物下游引物探针Mix(2×)lgllplllxl2．5I．tl109l12 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前J{J】胎盘组织中的表达Rox0．51alM92+(25mm)2．5“lH201．5lal总体积20Ltl荧光定量PCR反应条件为：95℃，2rain，热肩动；95℃，15s，变性；60℃，lmin，延伸，共计40个循环。1．3．4．7realtime—PCR结果计算根据标准品的不同浓度梯度Ct值来设计标准曲线；各样本的拷贝数通过与其对应的内参[3-actin比较后计算。获得理想的标准品扩增曲线的前提是梯度稀释的是否理想，只有梯度稀释的准确，标准品扩增曲线才能间隔均匀和标准曲线回归性才能准确，从而，获得的样本的定量才能准确。(如图1．1)A～__t--∞#HStandardCurvo图1．1realtime—PCR扩增曲线A：标准品扩增曲线：B：标准曲线；C：样本扩增曲线1．4统计学方法所有数据均采用SPSS17．0统计软件进行统计学分析。数据符合正态分布的以均数土标准差(X士S)表示，不服从正态分布的数据，经转化处理后服从正态分布，采用独立样本t检验，以Q=0．05作为检验水准。13C茑∞蔼男j∞"∞善∞n∞j舯‘％＼ 第喑15分：AI一2a及相关信号传导分=F在重度子痫前=|{}j胎稀组织中的表达2实验结果2．1HE染色结果HE染色显示红色箭头所指为绒毛滋养细胞，黑色箭头所指为绒毛外滋养细胞。因为HLA—G特异性地表达在人类绒毛膜外滋养细胞上，所以我们采用HLA．G免疫染色来证明绒毛外滋养细胞的表型特征。HE染色、阴性对照及HLA—G免疫染色见图2．1。图2．1苏小素．伊红(Hematoxylinandeosin，HE)染色、阴性对照及HLA．G免疫染色A：HE染色，B：阴性对照(以PBS代替一抗染色)：C：HLA—G免疫染色。STB(syncytiotrophoblast，合体滋养细胞)，EVT(extravillous仃ophoblast，绒毛外滋养细胞)。放人倍数均为10×20。2．2免疫组织化学检测结果2．2．1重度子痫前期组胎盘组织和正常对照组胎盘组织中AP-2a、Bax、Bcl．2、MMP．9、E．cadherin的定位及分布重度子痫前期组及正常对照组胎盘滋养细胞及绒毛外滋养细胞中均有AP．2a、Bax、Bcl一2、MMP．9和E．cadherin蛋白的表达。阳性染色细胞部位均可见清晰的棕色颗粒，其中AP．2et颗粒丰要分布于细胞核，细胞呈高于背景的棕黄色或深棕黄色，与正常对照组比较，在重度子痫前期组中AP．20c阳性细胞的数量明显较增多，染色强度也显著增强(图2C和图2D)。Bax、Bcl．2和MMP．914 第一部分：AP一2121及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达颗粒分布于细胞胞浆及细胞胞膜，细胞呈高于背景的棕黄色或深棕黄色，在重度子痫前期组中，Bax阳性细胞数量明显较正常对照组增多，其染色强度也显著增强(图2E和图2F)。而Bcl．2和MMP．9阳性细胞数量均较对照组减少，染色显著减弱(图3G、3H、3I和3J)。E—cadherin颗粒分布于细胞胞膜，细胞呈现高于背景的棕黄色或深棕黄色，重度子痫前期组E．cadherin阳性细胞数量较对照组明显增多，染色显著增强(见图3K和3L)。：’。一t、‘■，^f●t毋’自一*簟．+．’。-。··，EvT‘。4。●一+’f。8‘'℃t。。’正常对照组图2．2两组胎盘组织中AP．2a和Bax蛋白的免疫染色(sP法，10x20)AP一2n(A和B)及Bax(C和D)均在胎盘合体滋养细胞及绒毛外滋养细胞中表达。与正常对照组(A)比较，AP一2a在重度子痫前期组胎盘组织(B)中的表达显著增加。与正常对照组(C)比较，Bax在重度子痫前期组胎盘组织(D)中的表达显著增加。放大倍数为10N20。15 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达正常对照组重度子痫前期—k多EVT’、__—__·-_●卜⋯。h’．I，埝一I～．．●-’～EvTj．0基瑟吣’．～二舅图2．3两组胎盘组织中Bcl-2、MMP．9和E．cadherin蛋白的免疫染色(SP法，10x20)Bcl．2(E汞IF)、MMP一9(G和H)和E．cadhefin(I和J)均在胎盘合体滋养细胞及绒毛外滋养细胞中表达。与正常对照组(E)比较，Bcl．2在重度子痫前期组胎盘组织(F)中的表达显著降低。与正常对照组(G)比较，MMP．9在重度子痫前期组胎盘组织(H)中的表达显著降低。与正常对照组(I)比较，E．cadhefin在重度子痫前期组胎盘组织(J)中的表达显著增加。放人倍数为10×20。2．2．2重度子痫前期组胎盘组织和正常对照组胎盘组织中AP．2a、Bax、Bcl．2、MMP．9、E．cadherin的蛋白差异性表达根据免疫组化半定量公式HSCORE=Zpi(1+i)，pi代表阳性细胞所占的百分比，i代表染色强度，计算AP．2a、Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin蛋白在两组胎盘组织中的阳性表达，经统计学处理，结果见表2，分析如下：AP．2a、Bax和E．cadherin在重度子痫前期组胎盘组织中阳性表达分别明显高于正常对照组胎盘组织中的表达，两组间比较有统计学意义，P<0．05。Bcl．2和MMP．9在重度子痫前期组胎盘组织中阳性表达分别明显低于正常对照组胎盘组织中的表达，Bcl．2和MMP．9在两组间比较有统计学意义，P<0．05。16 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达表2两组胎盘组织中AP．2a、Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin蛋白表达的比较(SP法．X±S)注：水重度子痫前期组与正常对照组比较，P<0．052．3重度子痫前期组和正常对照组胎盘组织中AP．2a、Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherinmRNA的表达通过realtime．PCR方法，分别检测重度子痫前期组和正常对照组胎盘组织中AP一2a、Bax、Bcl．2、MMP．9和E．eadherinmRNA的表达，结果表明：在重度子痫前期组胎盘组织中AP一2a、E．eadhefin和Bax的mRNA表达明显高于正常对照组，经统计学分析，差异有统计学意义(木P<0．05)；而Bel．2、MMP一9的mRNA表达明显低于正常对照组，差异有统计学意义(枣尸<0．05)。(结果见图2．4)。“。r“1a1生b—j网I^I’2一a‰1xI{c1—2ⅥⅧ’9E-cadhcri”图2．4两组胎盘组织中AP．2a、Bax、Bci-2、MMP．9和E．cadherinmRNA表达3讨论子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有的疾病，于妊娠20周后，临床出现高血压、蛋白尿和(或)水肿等症状，随着患者孕周的增加，其症状加重，17卡T■■■■■■_654321O 第一部分：AP一2Q及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达常常逐渐发展成重度子痫前期及子痫。据统计，国外子痫前期发病率为5％．8％，我国发病率为9．4％．10．4％120J。由于重度子痫前期和子痫涉及到全身小血管痉挛，严重时可引发急性脑出血、急性。肾功能衰竭及HELLP综合征，同时又可引发胎盘早剥、胎盘功能减退、胎儿宫内生长受限和胎死宫内等并发症，所以，重度子痫前期和子痫已成为孕产妇和围产儿死亡的主要原因，也是导致早产儿和低出生体重儿的潜在因素121|。目前，由于重度子痫前期的理论依据不足，期待治疗效果甚微，而终止妊娠是其治愈的唯一有效途径，但却产生了早产等许多不良的后果，所以，研究重度子痫前期的发病机制刻不容缓，并成为国内外学者关注的焦点。重度子痫前期发病是多因素的，近些年产科学普遍认同，早期胎盘浅着床和血管重塑障碍是子痫前期发病的中心环节，而它们都与滋养细胞侵袭能力降低有关。滋养细胞穿过母胎界面达到母体蜕膜层并可深达子宫肌层外1／3，适度滋养细胞发生侵袭可促进母体螺旋动脉的重塑，使螺旋动脉发生扩张，增加血流量，以便利于母胎问的营养供应【221。当滋养细胞侵袭力增强或者减弱时，均可诱发产生病理妊娠，如葡萄胎、绒毛膜癌、胎盘植入、流产和子痫前期等。目前公认可通过两种方式来调控滋养细胞的侵袭行为：一、通过降解细胞外基质，影响滋养细胞的侵袭力【23J，二、通过滋养细胞凋亡途径，减少滋养细胞侵袭的细胞数量【24|，从而，滋养细胞向子宫肌层、蜕膜层及母体螺旋动脉等侵入不良，即发生胎盘“浅着床”和血管重塑障碍，可能最终引发重度子痫前期的各种临床症状。转录因子激活蛋白AP．2a是一种特殊序列的DNA结合蛋白，具有“basic—helix．span．helix”特异性结合DNA和形成同源或异源二聚体区域的特点，同时其N端富含脯氨酸和谷氨酰胺的转录激活区域，AP．2a利用自身结构的特殊性，与DNA直接结合，从而把信号传递给下游靶基因，如：MMP．2／9、TGF．q、c．Kit、c．myc、p21WAF／CIP、ER．P等，而在它们的启动子或增强子上，都有AP．2a结合位点与顺式调控序歹lJ[2引。转录因子AP．2毡通过开闭、增强或减弱等方式，调控这些下游靶基因的表达，从而参与正常组织的发育及细胞凋亡等的调控；当AP．2a表达异常时，通过这些机制，它又与肿瘤的发生及发展密切相关。目前关于转录因子AP．2a的研究，国内外多集中在肿瘤方面及胚胎发育等的研究，尤其是乳腺癌【261、恶性黑色素瘤【271、结直肠癌【28】及卵巢癌【29】等，发现在这些疾病中，存在AP．2a表达减少或缺失的现象，并且AP一2a的减少与肿瘤的恶性程度及发展有关，提示AP．2a可能是做为肿瘤抑制性基因而发挥作用的。18 第一部分：AP-2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达在眼角膜上皮细胞系SIRC细胞中，通过过表达或干扰SIRC细胞中AP．2a的表达，发现E．cadherin表达也随之增加或减少，这一研究说明AP．2a通过诱导眼角膜上皮细胞中E．cadherin的表达，而参与眼角膜上皮细胞的分化过程【j⋯。另外关于黑色素瘤的研究l”J，利用微阵列发现AP一2Q通过影响E—cadherin、MMP．2等的表达，从而影响黑色素瘤细胞的侵袭力。E—cadherin是一种细胞粘附分子，为单链跨膜糖蛋白，能介导同源细胞的粘附聚集【3引。当滋养细胞表面E．cadherin适度表达时，能有利于胚泡的粘附和植入133|。随着妊娠的进展，E．cadherin在滋养细胞上的表达逐渐减少，这有利于滋养细胞侵入母体螺旋动脉，保证母胎问生理功能的运行。有人也发现134|，重度子痫前期胎盘组织中E．cadherin表达异常增强，并引起滋养细胞侵润能力减弱；而当E．cadherin表达减少时，滋养细胞发生失控性增殖，对周围组织血管侵润过度，最终可引发绒癌，并可引起肿瘤细胞早期发生远处转移的现象|35|。本次研究也发现，在重度子痫前期胎盘组织中AP．2a、E—cadherinmRNA和蛋白的表达均高于『F常对照组，由于E．cadherin的启动子上有AP．2a转录激活区域，从而本次课题推测，AP一2a可能转录性激活E．cadherin的表达，从而，增加细胞问的粘附力，消弱了滋养细胞的侵袭力，促使胎盘浅着床。E．cadherin在子痫前期中的作用，可能是通过转录因子AP．2a介导得以实现的。妊娠滋养细胞的侵袭，同样也依赖于大量的蛋白水解酶降解细胞外基质，尤其以明胶酶为主的基质金属蛋白酶：MMP．2和MMP一9。MMP．2和MMP一9广泛表达于绒毛间质细胞，绒毛细胞外基质及绒毛滋养细胞及绒毛外滋养细胞等。MMPs参与妊娠期胎盘的形成和发育，并成为滋养细胞侵入的主要推动力136l。研究表明【37】，经过纯化的多克隆抗MMP．9抗体，能够阻断滋养细胞对基质层等的侵润作用，这说明MMP．9对滋养细胞侵袭行为，起着重要的正调节作用。而Lim【38】体外培养子痫前期患者胎盘滋养细胞，发现MMP．9mRNA和蛋白的表达均减少，而且滋养细胞侵袭能力也显著降低，这一现象说明，MMP．9低表达，可能引起滋养细胞侵润子宫肌层不足，导致胎盘浅着床，引发子痫前期的发病，但MMP．9在子痫前期发病中受何种因素的调控，目前国内外研究甚少。而本次课题发现，在重度子痫前期胎盘组织MMP．9mRNA和蛋白的表达也显著下降，这与既往研究结果相符合，同时也说明，MMP．9的表达在转录水平就已经被抑制。分析MMP．9的结构发现，MMP．9除了含有MMPs家族共有的氨基末端和锌离子结合区域外，还富含脯氨酸长度为54个氨基酸残基的序列，这与AP．2a19 第一部分：AP一2Q及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达具有同源的序列，MMP一9基因是受AP．2cc转录性调控的【39】，所以在子痫前期发病过程中，AP．2a可能是通过结合MMP．9这一区域，负性调控MMP．9的转录，从而引起MMP．9分泌不足，导致滋养细胞侵袭力减弱，胎盘血管形成的数量不足，深度不够，从而降低了胎盘血流的灌注，在子痫前期发病机制中，可能发挥着重要的作用。多项研究发现14⋯，子痫前期患者胎盘滋养细胞、合体滋养细胞、蜕膜细胞的凋亡数量均显著高于正常同孕龄妊娠者，说明细胞凋亡可能与子痫前期的发病有一定的相关性。而Bcl．2家族对细胞凋亡通路调控备受曙目，Bcl．2基因即B细胞淋巴瘤／白血病．2基因(B．celllymphoma／Leukemia2)，是从人滤泡性淋巴瘤中t(14；18)染色体易位的断裂点位置克隆得到的，是第一个被发现能抑制细胞凋亡的原癌基因，其中Bax和Bcl．2基因是一对重要的细胞凋亡调控基因，它们可以形成二聚体结构，或者Bax自身形成同源二聚体结构，参与细胞凋亡过程14¨。当Bax和Bcl．2平衡失调时，就会发生促进或抑制细胞凋亡的现象。王欣【42J等采用RT-PCR方法，检测Bcl．2、Bax和BakmRNA在正常足月胎盘组织与轻度、重度子痫前期胎盘组织中的表达，发现Bcl．2和Bax的mRNA存在差异性表达。而本次研究也发现：重度子痫前期胎盘滋养细胞和绒毛外滋养细胞中，Bcl．2mRNA和蛋白的表达均低于正常对照组，而BaxmRNA和蛋白的表达则显著高于正常对照组。从而推测，Bcl．2／Bax可能参与子痫前期的病理生理过程。但Bcl．2／Bax是否也受AP．2a转录性调控，目前国内外尚未研究。综上研究所述，AP一20r作为转录因子，可能通过调控其下游基因：E—cadherin、MMP．9、Bcl．2和Bax的表达，影响滋养细胞的侵袭性，而在子痫前期的发病机制中起着关键性的作用。4小结本研究体内实验揭示AP．2a及E．cadherin、MMP．9、Bax和Bcl．2在重度子痫前期胎盘组织中异常表达。20 第一部分：AP一2Q及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达参考文献Wessel13lAnneliesR，GoukeJ，eta1．Arandomizedcontrolledtrialcomparingtwotemporizingmanagementstrategies，onewithandonewithoutplasmavolumeexpansion，forsevereandearlyonsetpreeclampsia【J】．BJOGl2005，112(10)：1358—1368．RepA，GanzevoortWjBonselGJ，eta1．Psychosocialimpactofearly—onsethypertensivedisordersandrelatedcomplicationsinpregnancy【J】．AmJObstetGynecol，2007，197(2)：158．el一6．MaRQ，SunMN，YangZ．Effectsofpreeclampsia—likesymptomsatearlygestationalstageonfeto·placentaloutcomesinamousemodel．ChinMedJ(En91)，2010，123(6)：707—712．KujovichJLThrombophiliaandpregnancycomplications[J]．AmjObstetGynecol，2004，191：412—424．OrsoEPennaE，CiminoD，eta1．AP一2alphaandAP一29ammaregulatetumorprogressionviaspecificgeneticprograms[J]．FASEBJ，2008，22：2702·2714．WenkeAKBosserhoffA艮RolesofAP-2transcriptionfactorsintheregulationofcartilageandskeletaldevelopment．FEBSJ，2010，277(4)：894—902．BennettKL，RomiqhT，EngC．AP一2aInducesEpigeneticSilencingofTumorSuppressiveGenesandMicrosatelliteInstabilityinHeadandNeckSquamousCellCarcinoma．PLOSOne，2009，4(9)：e6931．SchwartzB，MelnikovaVO，TellezC，eta1．LossofAP一2ctresultsinderegulationofE—cadherinandMMP一9andanincreaseoftumorigenicityofcoloncancercellsinvivo[J]．Oncogene，2007，14：4049-4058．KatarzynaBiadasiewicz，StefanSonderegger,PeterHaslinger，eta1．TranscriptionfactorAP一2apromotesEGF·dependentinvasionofhumantrophoblast[J]．Endocrinology,2011，152：1458—1469．MichaelA．Hubert，SusanLSherritt，CindyJ．Bachurski，eta1．InvolvementoftranscriptionfactorNR2F2inhumantrophoblastdifferentiation[J]．PLOSONE，2010，5(2)：e9417．SeijiNomura，TomomiIto，EikoYamamoto，eta1．Generegulationandphysiologicalfunctionofplacentalleucineaminopeptidase／oxytocinaseduringpregnancy[J]．BiochimicaetBioph。ysicaActa，2005，1751，19—25．NoaShef，NatalieYivgi—Ohana，JosephOily．TranscriptionalregulationoftheCholesterolsidechaincleavagecytochromeP450gene(CYPllAa)revisited：bindingofGATA，Cyclicadenosine3’，5'-monophosphateresponseelement—bindingproteinandactivatingprotein(AP)一lproteinstoadistalnovelclusterofcis—RegulatoryElementsPotentiatesAP一2andSteroidogenicfactor-l-Dependentgeneexpressionintheredentplacentaandovary[J]，M01．Endocrinol，2007，21：948·962．ThewesVOrsoEJagerR，eta1．Interferencewithactivatorprotein-2transcriptionfactors211】1】0123n口p眄p降p阻n口n 第一部分：AP一2a及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达【20】【21】【22】【23】[24】【251【26】【27】【28】leadstoinductionofapoptosisandanincreaseinchemo·-andradiation··sensitivityinbreastcancercells[J]．BMCCancel2010，10：192．XuYPorntadavityS，StClairDK．Transcriptionalregulationof．thehumanmanganesesuperoxidedismutasegene：theroleofspecificityprotein1(Spl)andactivatingprotein一2(AP一2)[J1．BiochemJ，2002，362：401—412LiSY,ShangT，LiSJ，eta1．Lipopolysaccharideinducesapoptosisofcytotrophoblastsbyactivatinganinnateimmunereactioninvitro[J]．ChinMedJ(En91)，2007，120：1353-1359。SethGuller．Roleofthesyncytiuminplacenta—mediatedcomplicationsofpreeclampsia[J]．ThrombRes，2009，124(4)：389—392．AbumareeMH，StonePR，ChamleyLW．Changesintheexpressionofapoptosis·relatedproteinsinthelifecycleofhumanvilloustrophoblast[J]．ReprodSci，2012，19：597-606．J．Ray,A．Jurisicova．I．Caniggia．IFPAtrophoblastresearchawardlecture：ThedynamicroleofBcl一2familymembersintrophoblastcellfate[J]．Placenta，2009，23：$96一S100．NishizawaH，OtaS，SuzukiM，eta1．Comparativegeneexpressionprofilingofplacentasfrompatientswithseverepre—eclampsiaandunexplainedfetalgrowthrestriction[J]．ReprodBiolEndocrinol，2011，9：107．Kkanasaki，Rkalluri．Thebiologyofpreeclampsia【J】．Kidneyinternational，2009，76(8)：831-837．MassardierJ，GolfierF，JoumetD，eta1．Twinpregnancywithcompletehydatidiformmoleandcoexistentfetus：obstetricalandoncologicaloutcomesinaseriesof14cases[J]．EurJObstetGynecolReprodBiol，2009，143(2)：84—87．PrinqleKGKindKL,Sferruzzi—Pe玎iAN，eta1．Beyondoxygen：complexregulationandactivityofhypoxiainduciblefactorsinpregnancy[J]．HumReprodUpdate，2010，16(4)：415—431．GST．J．Whitley,J．E．Cartwright．Cellularandmolecularregulationofspiralarteryremodeling：lessonsfromthecardiovascularfieldIJ]．Placenta，2010，31(6)：465—474．ERay,JGarcia，AJurisicova，eta1．Mtd／Boktakesaswing：proapoptoticMtd／Bokregulatestrophoblastcellproliferationduringhumanplacentaldevelopmentandinpreeclampsia[J]．CellDeathDifferentiation，2010，17：846-859．Orso，F，PennaE，CiminoD，etal，AP一2位andAP一2yregulatetumorprogressionviaspecificprograms[J]．FASEBJ，2008，22：2704-2714．PoweDGAkhtarqHabashyHO，eta1．InvestigatingAP-2andYYlproteinexpressionasacauseofhighHER2genetranscriptioninbreastcancerswithdiscordantHER2geneamplification[J]．BreastCancerRes，2009，11(6)：R90．VladislavaO，Melnikova，MenasheBar-Eli．Transcriptionalcontrolofthemelanomamalignantphenotype[J]．CancerBiologyTherapy,2008，7(7)：997—1003．ChoinHJ，ChungTw：KimSJ，eta1．TheAP一2alphatranscriptionfactorisrequiredforthegangliosideGM3-stimulatedtranscriptionalregulationofaPTENgene[J]．Glycobiology,22卅习q刁剐卅n口n 第一部分：AP一2o及相关信号传导分子在重度子痫前期胎盘组织中的表达2008，18：395。40Z．．【29】OdegaardE，StaffAC，KaernJ，eta1．TheAP一2丫transcriptionfactorisupregulatedinadvanced·stageovariancarcinoma[J]．GynecolOncol，2006，100：462-468．【30】JudithA．West,-Mays，JeremyM．Sivak，eta1．PositiveinfluenceofAP一2仪transcriptionfactoroncadheringeneexpressionanddifferentiationoftheocularsurface．Differentiation．2003，71(3)：206-．216．【31】EigoSuyama，HiroshiMinoshima，HiroakiKawasaki，,eta1．IdentificationofAP·-2,一regulatedgenesbymacroarrayprofilingofgeneexpressioninhumanA375Pmelanoma．NucleicAcidsResearchSupplement．2002．2：247一．248．【32】ArimaY，lnoueY，ShibataT，eta1．RbDepletionResultsinDeregulationofE--CadherinandInductionofCellularPhenotypicChangesthatAreCharacteristicoftheEpithelial—to—MesenchymalTransition[J]．CancerRes，．2008，68(13)：5104--5112．【33】BenaitreauD，DosSantosE，LeneveuMC，eta1．AdiponectinpromotessyncytialisationofBeWocellfineandprimarytrophoblastcells[J]．ReprodBiodEndocrinol，2010，8：128．【34】Arimoto—IshidaE，SakataM，SawadaK，eta1．Up·Regulationofa5一IntegrinbyE-CadherinLossinHypoxiaandItsKeyRoleintheMigrationofExtravillousTrophoblastCellsduringEarlyImplantation[J]．Endocrinology,2009，150(9)：4306．·4315．【35】安瑞芳，张勇华，林耀华等．绒毛膜癌细胞的融合与侵袭和转移能力变化关系的研究【J】．实刚妇产科杂忠，2011，27(2)：114．．117．【36】GSt．J．Whitley,J．E．Cartwright．Cellularandmolecularregulationofspiralarteryremodelinglessonsfromthecardiovascularfield[J]．Placenta，．2010，31(6)：465-474．【37】WangH，Li0，ShaoL，eta1．Expressionofmatrixmetalloproteinase一2，一9，一14，andtissueinhibitorsofmetalloproteinase．-1，--2，一3intheendometriumandplacentaofrhesusmonkey(Macacamulatta)duringearlypregnancy[J]．BiologyofReproduction，2001，65(1)：31-40．【38】LimKH，ZhouY，JanatpourM，et，a1．HumanCytotrophoblastdifferentiation／invasionisabnormalinPre·-eclampsia[J]．AmJPathol，1997，151：1809．1818．【39】PellikainenJM，RopponenKM，KatajaVVeta1．ExpressionofMatrixMetalloproteinase(MMP)一2andMMP．9inBreastCancerwithaSpecialReferencetoActivatorProtein．．2，HER2，andPrognosis[J]．ClinCancerRes，2004，10(22)：7621·．7628．【40】GuoHR，LUSQ．Thestudyofpathogenesisinpreeclampticpregnancies[J]．ChinJMisdiagn，2008，,4(2)：776．-778．【F41】SenthilV，RamadeviS，VenkatakrishnanV．eta1．WithanolideinducesapoptosisinHL-60leukemiacellsviamitochondriamediatedcytochromeCreleaseandcaspaseactivation[J]．Chemico—BiologicalInteractions．2007，167-19--30．【42】王欣，王小青，刘晓梅等．细胞凋亡相关基因Bcl一2、Bax、BakmRNA在子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义【JJ．JSoutheastUniv,2009，28(6)：496．499． 第二部分：AP一2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作川的研究第二部分：AP．20r对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究根据第一部分研究结果提示：重度子痫前期胎盘组织中AP．20L、E—cadherin和Bax的表达异常增高，MMP．9及Bcl．2的表达异常降低。Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin均为AP．2Q下游调控靶基因，因此，我们推测，AP一2仅可能直接通过转录性调控胎盘组织中Bax、Bcl．2、MMP．9和E．cadherin的表达，影响滋养细胞生物学行为，而诱导子痫前期的发生及发展。所以本部分课题旨在，体外培养人绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞，BeWo细胞可替代正常胎盘滋养细胞，作为研究滋养细胞分化、侵袭及凋亡等生物学功能的模型【11，构建AP一2et真核表达载体，分别采用AP．2a表达载体和AP．20tsiRNA瞬时转染BeWo细胞，通过realtime．PCR及Westernblot方法，分别检测BeWo细胞中Bax、Bcl一2、MMP．9和E—cadherinmRNA及蛋白的表达，同时观察，AP一20【基因对BeWo细胞增殖、侵袭及凋亡的影响，从而进一步探讨，AP．20L基因在子痫前期发病中可能的作用，为今后临床实验和治疗子痫前期提供新的理论依据。1材料与方法1．1材料1．1．1绒毛膜癌滋养细胞株(BeWo)绒毛膜癌滋养细胞株(BeWo细胞)购于武汉大学研究所。BeWo细胞在含有15％胎牛血清的Ham’F12培养基37℃，C02孵育箱中培养。每隔3天换新鲜培养液，当细胞长满瓶底后，用0．25％胰酶消化分散，进行传代培养。1．1．2引物及质粒plRES2．EGFP是一个大小为5．3kb的真核表达载体，为了增强其敏感度，采用增强绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)作为报告基斟51，编码基因与目的基因AP．2ct偶联后，构成了AP．2Q基因的正义载体，可以动态观察AP．2a基因在活细胞或生物体内的表达、分布及效应。24 第二部分：AP．2ct对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究、≯罄i≥孓√、。⋯。qHrI。．『l二v{j’／图1真核表达质粒plRES2-EGFP结构图引物设计：引物设计参照NCBIReferenceSequence：NM003220．2及金斯瑞生物技术公司的CloneEZ固重组克隆试剂盒，引物设计原则设计引物。包含了AP。2cc基因的全部CDS区域，大小约为1314bp。根据这个序列，设计引物，为克隆准备。AP．2ctCDS引物序列如下：(红色：EcoRI酶切位点，蓝色：BamHI酶切位点)。上游引物：5’CTCAAGC'ITCGA芦江TCGCCACCATGCllTGGAA铘GACG3’下游引物：5’GAGAGGGGCGGATCCTCACl]rrCTGTGCITCTCCTarr3’1．1．3主要实验试剂胎牛血清美国Hyclone公司Ham’F12培养基美国GIBCO公司0．25％胰蛋白酶北京鼎国生物技术有限公司限制性内切酶(EcoRI，BamHI)上海艾普拓普生物科技有限公司T4DNAligase大连宝生物公司dNTP大连宝生物公司RT-PCRKit大连宝生物公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒上海生工生物技术有限公司溴化乙锭(EB)上海生工生物技术有限公司DNAPurificationKit大连宝生物公司凝胶回收试剂盒北京百泰克生物技术有限公司 第二部分：AP．20【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究质粒小量提取试剂盒质粒去内毒素纯化试剂盒逆转录试剂盒DL2000DNAMarker电泳琼脂糖Trizol试剂FUGENEHD转染试剂plRES2一EGFP／AP一2a质粒plRES2一EGFP质粒Transwell小室MatrigelMTTAP．2a抗体E．cadherin抗体MMP一9抗体13-actin抗体DMS0PVDF膜苯甲基磺酰氟(PMSF)SDS丙烯酰胺(Acr)甲叉双丙烯酰胺(Bis)二巯基乙醇Tween．20蛋白质Marker1．1．4主要仪器C02恒温细胞培养箱恒温水浴箱低温高速离心机Ti．S型倒置荧光显微镜26北京百泰克生物技术有限公司大连宝生物公司西班牙BlOWEST公司大连宝生物公司Roche，U．S．A本实验室构建并保存上海艾普拓普生物科技有限公司Biorad试剂公司美国SantaCruz公司丹麦DOKO公司美国SantaCruz公司北京索莱宝科科技公司SIGMA生物试剂公司Biorad试剂公司华美生物试剂公司Biorad试剂公司华美生物试剂公司德国Heraeus公司上海安亭科学仪器厂德国Heraeus公司日本NIKON公司 第二部分：AP一2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究BX41显微镜420型恒温摇床1300型超净工作台超低温冰箱(一80℃)普通冰箱移液器StepOnePlus荧光定量PCR仪台式高速40C冷冻离心机9700Geneamp定量PCR仪凝胶成像系统水平电泳系统DYY-7B垂直电泳系统电转移装置核酸蛋白微量测定仪紫外分光光度计DU640日本Olympus公司江苏兴华分析仪器厂苏净安泰公司同本三洋日本三洋德国Eppendorf公司美国ABI公司德国Eppendoff58公司美国ABI公司UVPGDS8000美国北京六一仪器厂美国BioRad公司美国NanoDropThermo美国BakerMan公司1．1．5主要试剂及其配置1．F12培养基F12粉剂(美国Gibco公司)109NaHC031．29用1000ml去离子水定容，加入INNaOH或1NHCL调节PH值，使酸碱度为：7．2．7．4。采用0．22pm微孑L滤膜，滤过除菌后分装入瓶，．20。C保存。用时加入15％胎牛血清。2．MTT溶液：称取MTT0．5克，溶于100mlPBS(PH7．4)，用0．22pm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装后4℃避光保存。3．细胞冻存液：Ham’F12培养液7ml、胎牛血清2ml、DMSOlml。4．EB储存液：100mgEB，加入去离子水100ml，充分搅拌使其完全溶解，室温避光保存。5．LB培养基配制(1L)：胰蛋白胨109；酵母提取物59；Nacl109；H20加至1L。采用NaOH调节PH值约7．0左右。6．分离胶缓冲液：1．5mmol／LTris—HCL(pH8．8)-18．159Tris和48mllmol／LHCL 第二部分：AP．2n对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究混合，加水稀释到lOOml终体积，过滤后4"C保存。。7．浓缩胶缓冲液：0．5mmol／LTris．HCL(pH6．8)：6．059Tris溶于40mlH20中，用约48mllmol／LHCL调至pH6．8加水稀释到100ml终体积，过滤后4℃保存。8．5xSDS上样缓冲液：0．5mol／LTris．HC“pH6．8)2．5ml、DTI"0．399、SDSO．59、溴酚蓝0．025、甘油2．5ml，将以上混匀后，分装到1．5mlEP管内，4℃保存。9．电泳缓冲液：Tris30．39，甘氨酸18．779，SDSlg，用蒸馏水溶解至1000ml，也可以配制10x电泳缓冲液，稀释10倍使用。10．转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取甘氨酸2．99、Tris5．89、SDS0．379，并加入甲醇200ml，加水至总量1L。11．5％脱脂奶粉：59脱脂奶粉、100mlTBST，配成100ML，现配现用。12．SDS．PAGE凝胶配制：15．磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液：在800ml蒸馏水中溶解89NaCl、O．29KCI、1．449Na2HP04和0．249KH2P04，用HCl调节溶液的pH值至7．4，加水定容至1L，保存于室温。16．10mmol／L苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液：用异丙醇溶解PMSF成1．74mg／ml(10mmol／L)，分装成小份贮存于．20℃。如有必要可配成浓度高达17．4mg／ml的贮存液(100mmol／L)。17．溴化乙锭(10mg／ml溶液)：在100ml水中加入19溴化乙锭，磁力搅拌数小时，以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器，或转移至棕色瓶中，保存于室温。18．0．5mol／1EDTA(pH8．0)溶液：在800ml水中加入186．19二水乙二胺四乙酸二钠，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8．0(约需209NaOH颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。19．30％丙烯酰胺溶液：将299丙烯酰胺和19N，N’。亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene 第二部分：AP．2ct对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究滤器(0．45I_tm孔径)过滤除菌，置棕色瓶中保存于室温。20．10g／L溴酚蓝溶液：500mg溴酚蓝加双蒸水50mL，搅拌溶解，倒入棕色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱保存。不用过滤。用时注意吸取上层澄清液，不要吸到沉淀。21．G250考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G2500．19；95％乙醇50ml；磷酸100ml，加水至1000ml。22．100mg／ml牛血清白蛋白(BSA)：BSA0．19，O．15mol／LNaCLlml，溶解后一20。C保存。蛋白标准曲线时用0．15mol／LNaCL100倍稀释成1m∥ml，．20。C保存。1．2实验方法1．2．1真核表达载体plRES2．EGFP／AP．2a的构建1．2．1．1提取人胎盘组织细胞总RNA采集人胎盘组织细胞，提取总RNA，具体提取方法同第一部分。1．2．1．2以mRNA为模板，进行逆转录反应(realtime．PCR)以设计的realtime．PCR引物为引物。以胎盘组织细胞总RNA为模板，进行realtime—PCR反应。逆转录反应体系：模板RNA溶液5“L5xRTbuffer4“LdNTP(10mmol／L)2“LRNA酶抑锖0剂0．5“LOligo(dT)引物lpLAMV反转录酶lpLDEPC水6．5pL总体积20p,L逆转录反应条件：42℃保温1h，置95℃，温育5min，使AMV反转录酶失活。将此反转录产物直接进行PCR反应。1．2．1．3PCR反应扩增反转录产物cDNA利用realtime．PCR仪，将上述获得的AP．2acDNA产物进行扩增。29 第二部分：AP．20【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究反应体系如下：反转录产物lpL’dNTPmixture(10mM)lpL10xTaqBuffer2pLTaqDNApolymeraselpLAP．CZF引物llxLAP—CZR引物llaL补去离子水至209LPCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，、65℃退火30s，>共30个循环72℃延伸1min，J最后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(100V，30min)，凝胶成像系统拍照，并检测扩增是否成功。1．2．1．4连接反应1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收AP一2aPCR产物，及经EcoRI和BamHI双酶切plRES2一EGFP空载体。利用CloneEZ⑧重组克隆试剂盒，重组plRES2．EGFP和AP．2aPCR产物，获得的产物命名为pIRES2．EGFP／AP一2a。其体系及反应条件如下：将下列混合物小心加到0．5ml的eppendorf管的管底，或PCR管的管底(如果不慎将液体粘在管壁，务必通过短暂离心，使其沉入管底)。plRES2一EGFP线性化载体3“l纯化的PCR产物121xl10XCloneEZBuffer2lalCloneEZEnzyme2pl去离子水补足20“l将其混合物在22℃保持30min，之后在冰上保持5min。1．2．1．5转化冰上融化一管100肛l的感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入20pl30 第二部分：AP．2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育30min。42℃水浴中热激90s，冰上孵育2min。向管中加入800mlLB液体培养基(不含卡那霉素)，混匀后j37。C振荡培养45min，使细菌恢复『F常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Kan‘o6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清，剩余lOOpl上清，重悬菌体。将菌体均匀的涂布在LB固体培养基平板(含100I，tg／mL卡那霉素)上，37℃倒置过夜培养。挑取单克隆进行PCR鉴定阳性克隆，预期产物大小为1314bp，反应总体积为25ul。反应体系如下：lOxBuffer灭菌双蒸水dNTPmixture(10mM)AP-2ctCZF(10I．tmol／L)AP一2GtCZR(10pmol／L)菌液Taq(5U／肛L)总体积PCR反应条件：95℃预变性3min，956C变性30S，．65℃退火30S，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10rain。1．2．1．6选取菌液PCR鉴定为阳性克隆的菌液进行测序为了进一步验证重组plRES2．EGFP／AP．20【质粒，将菌液取lOOpl送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，将剩余的菌液加入等体积的30％甘油，置于．80℃保存。1．2．1．7重组质粒的大量制备取表达AP一2Q的重组质粒plRES2．EGFP／AP．2a的菌液，用碱裂解法大量抽提和纯化重组质粒。紫外分光光度仪检测其纯度：260nm／280nm比值为1．8；其浓度为O．1-2．OI．tg／rtl。31．∽5p∞m肼驰ⅥⅥ眦一砒 第二部分：AP．2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究1．2．2BeWo细胞复苏、培养、传代及冻存1．2．2．1BeWo细胞复苏①从液氮罐内取出冻存的BeWo细胞，快速置入37。C水浴缸内，快速融化；②将融化的冻存管移至工作超净台，吸出管内的BcWo细胞液，移入新的离心管中，加入4ml培养液；③室温，1000rpm离一tl,8min；④弃上清液，向离心管内加入2ml15％FBSHam’F12培养液，充分混匀；⑤各取lml细胞悬液，移至装有5ml15％FBSHam’F12培养液的培养瓶中，充分混匀；⑥培养瓶上标注细胞名称、时间及编号；⑦移置倒置显微镜下观察，可见细胞数量较多，密度不小于lxl05／ml。1．2．2．2BeWo细胞培养及传代①将BcWo细胞悬液接种到细胞培养瓶，放置于37。C、5％C02培养箱，15％FBSHam’F12培养基培养，细胞贴壁生长。2—3天进行细胞换液一次，倒置显微镜下观察细胞生长情况的变化，当细胞达到70—80％左右融合时，即可以开始传代；②移除培养瓶中的旧培养液，向培养瓶内加入lml0．25％胰蛋白酶液，室温静置lmin，37。C温育2min，轻拍培养瓶壁，可见细胞大量脱落，胞质回缩；③向培养瓶内加入3mlHam’F12培养液，中和消化；④吸出培养瓶内的细胞悬液，移置到一新的离。tl,管中；⑤室温，1000rpm，离一tl,5min；⑥移除上清液，PBS液清洗，离心后移除PBS液；⑦向离心管内加入含15％胎牛血清的Ham’F12培养液，保持细胞悬液为5ml；⑧置于倒置显微镜下观察，细胞基数较多；⑨将培养瓶移入37。C、5％C02培养箱，继续培养。1．2．2．3BeWo细胞冻存取对数生长期的BeWo细胞，采用0．25％胰蛋白酶消化并终止后，1000rpm离心5min，弃上清液，细胞计数后，按1×106-lxl07的密度，将lml冻存液(10％DMS0)加入细胞沉淀物，吹打均匀，将细胞悬液分装2个无菌细胞冻存管内(O．5m1)，依次进行：4。C冰箱30min、．20℃冰箱2h、．75℃冰箱过夜后，32 第二部分：AP．20【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究投入液氮罐内冻存。1．2．3真核表达载体plRES．EGFP／AP．2u转染BeWo细胞组别干预因素空白细胞组无空质粒组转染plRES2一EGFP质粒BeWoAP一2a细胞组转染plRES2一EGFP／AP．2a质粒1．2．3．1细胞转染1．BeWo细胞转染按照FugeneHD提供的操作方法进行：转染前，将对数生长期的BeWo细胞用0．25％的胰蛋白酶消化，以大约lxl06个细胞／孔移置到6孔培养板，向培养孔内加入含15％FBS的Ham’F12液，当BeWo细胞接近70％融合时，即开始转染。2．弃去旧培养液，每孔BeWo细胞加入lml无血清的Ham’F12培养液，按照FugeneHD转染试剂说明：使用无血清的培养基，将转染试剂稀释到终浓度为69l转染试齐0／100rtl培养基，即复合物比率为6：2，并轻轻混匀。3．将299DNA加入100}tl转染试剂稀释液里，轻柔混匀，将转染试剂和质粒DNA复合物放置于+15至+25℃，孵育15min；4．取转染试剂和质粒DNA混合液1001xl加入装有BeWo细胞悬液的6孔板中继续置于5％C02，37。C的培养箱中培养，每次转染做三次重复。1．2．3．2转染效率检测转染48h，荧光显微镜下观察转染效果，并分别采用realtime．PCR及Westernblot方法检测AP．2a基因及蛋白的表达：realtime．PCR反应具体步骤同第一部分内容；Westernblot方法检测，具体步骤如下：1．BeWo细胞总蛋白的提取1)将装有BeWo细胞的6孔培养板放置于冰上，用预冷的lmlPBS洗涤各培养板孔内的BeWo细胞各2次；2)向每个孔内分别加入300}tl蛋白裂解液(含有PMSF)，裂解30min，用细胞刮板轻轻刮细胞，将细胞碎片及裂解液吸入到新的1．5ml的EP管内；为了使细胞裂解彻底，整个过程需要在冰上来回摇动培养板；33 第二部分：AP．2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究3)4。C，120009，离心10mira4)将上清液吸入到新的1．5ml的EP管内，即为BeWo细胞的总蛋白。2．BeWo细胞浓度的测定：采用考马斯亮蓝的方法1)实验设标准管、样品管和空白管，采用牛血清白蛋白配制蛋白，向空白管内加入0．01ml蒸馏水，考马斯亮蓝GBBG250液lml；向标准管内加入0．01ml1m∥m1的标准液，考马斯亮蓝GBBG250液lml：向样品管内加入0．01ml样品，考马斯亮蓝GBBG250液lml。其中蛋白标准液的浓度测定为0．84199／gl，用时用O．9％NaCl液稀释为1¨∥Ixl，将以上混液充分混匀后，静置放置15min，用酶标仪测定OD562吸光度值，空白管调零后，分别测各管的吸光度值。采用的计算公式为：样品蛋白浓度(pg／91)=样品管OD值／标准管OD值X标准管的浓度X稀释倍数2)根据检测结果，用裂解缓冲液调整各个标本到相同蛋白浓度，加入5xSDS上样缓冲液，至终浓度为1×，其余的补充为水即可。(上样总体积一般不超过201x1)。上样前将样品放置于沸水中，煮10min，使蛋白变性。3．蛋白样品的SDS．聚丙烯酰胺凝胶1)制备SDS．PAG凝胶用洗衣粉清洗玻璃板的两面，先用清水冲洗，再用蒸馏水充分清洗后，竖着晾干。玻璃板对齐后，放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，用于灌胶。用配制10％分离胶10ml灌入到凝胶板中，分离胶一定要沿着玻璃板留下来，这样，分离胶中就不会产生气泡；然后，在胶上加入一层水，可以加快凝胶的速度。放置室温30min，当水和胶中问有一条折射线时，说明胶已经凝固，就可以小心倒掉胶上层的水，并用吸水纸充分吸干。配制新鲜的5％浓缩胶5ml，将剩余空问灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，放置室温30min。灌胶时，也需要小心将胶沿着玻璃板流下，防止气泡产生，而插梳子时，要使梳子水平放置；另外，胶凝固时体积会变小，所以，在浓缩胶凝固的过程中，要不断地在两边补胶。一旦浓缩胶充分凝固后，就可以把梳子拔出来。2)蛋白上样和电泳将浓缩胶用清水冲洗后，放入电泳槽内。蛋白的上样量为30pg及5pl蛋白marker分别加入孔内，在浓缩胶时采用80V电压跑，等溴酚蓝电泳跑至分离胶交界处，电压改为100V，一直到电泳跑到分离胶的底部时，就开始转膜了。 第二部分：AP一2u对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究3)转膜操作前先带上手套，防止污染膜，裁剪6张7cm大小的滤纸和1张同样大小的O．229m小孔的硝酸纤维素膜，用镊子捏住，将硝酸纤维素膜的一边轻轻地放置于水上，只有膜的下层与水接触，浸泡2h后使用。然后分别在硝酸纤维素膜上和凝胶面，各加上3层滤纸，最后，放于两层支持垫之间，赶跑气泡后夹紧，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面，即硝酸纤维素膜位于正极面，而胶位于负极面，放入充满转移液的电泳槽内。连上电源，采用300mA电转2h，转膜结束后，将膜用1×丽春红染液染至约5min，可以看到各个泳道上的蛋白条带。4)免疫反应①转膜后将膜放置自制的含有5％脱脂奶粉／TBST封闭液的杂交袋里，室温，摇床上摇动，封闭1h；②一抗用TBST稀释(AP．2tl：1：1000，E—cadherin：1：800，MMP一9：1：1000，13-actin：1：1000)；室温孵育2h后，用TBST在室温下洗膜脱色10minx3次；③小一tL,用镊子把膜取出，放置于新的杂交袋罩，加入二抗，然后，压紧膜并封住杂交袋的口，继续放于摇床上摇动1h；④用TBST洗膜脱色10minx3次：5)化学发光及显影将ECL发光试剂盒中的A液和B液各取出lml，混匀，将膜蛋白充分与混合液接触，将膜移至一新的保鲜膜上，包好，放入x一光片兴里。在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中，打开X．光片夹，把X．光片放在膜上，关闭X．光片夹，计时，开始曝光，取出x．光片，迅速放入显影液中显影，出现明显条带后，一般需要1-2min，终止显影，用自来水冲洗，再把X．光片置入到定影液里，5min后，自来水冲洗，室温晾干。6)结果分析用Bio—RAD2000型凝胶成像系统扫描胶片，以l}-actin作为内参，用图像分析软件，将三次重复实验的蛋白条带，进行灰度值统计分析。1．2．3．3MTr法检测转染前后BeWo细胞的增殖1)称取MTT0．5克，溶于100mlPBS(PH7．4)，用0．2211m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装后4℃避光保存；35 第二部分：AP．2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究2)取转染24h、36h、48h和72h的两组细胞(空质粒细胞组、plRES2一EGFP／AP．2a细胞组)，并设空白细胞组(仅加培养液)，每种细胞接种6孑L，3孔重复，以每孔2x103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为2009l：3)每孔加入MTT液209l(5mg／m1)，继续放入5％C02，37。C培养箱中培养4h；4)终止培养，小心吸出所检测培养孔中含有MTT的培养液，然后每孔加入1509l冻存液DMSO，震荡10分钟，彻底溶解MTI'；5)用490nm波长的酶标仪，在酶联免疫检测仪上检测每个孔的吸光度值(OD值)；并以时问为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制BeWo细胞增殖曲线。1．2．3．4转染前后BeWo细胞侵袭力。的检测(Transwell法)1)0．25％胰酶消化处于对数生长期的三组细胞(空白细胞、转染空载体细胞、转染plRES2．EGFP／AP．2a细胞)，以无血清的Ham’SF12培养基，配置成单细胞悬液，使细胞浓度为2x105个／ml。2)以50mg／L的Matrigel基质胶：Ham’SF12培养基=1：8的比例，稀释Matrigel基质胶，注意：培养基要冰上预冷，稀释时要严格冰上操作，因为Matrigel基质胶在室温下，会不可逆凝固。3)取609l左右稀释好的Matrigel基质胶，加入TransWell小室底部膜的上室面，以刚好覆盖TransWell小室底部聚碳酸酯膜为宜。37℃、30min，使Matrigel基质胶凝固。4)JIl页,着TransWell小室侧壁的加液孑L，．向24孔培养板中加入500ul含有15％血清的Ham’SF12培养基，向TransWell小室中加入2001．tl无血清的细胞悬液，每组细胞做2个复孔。5)37℃，5％C02培养箱中培养48h，取出向TransWell小室，PBS温柔冲洗，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞，膜下层细胞0．04％台盼蓝染色后，将TransWell小室倒扣于正置显微镜下，计数侵袭到膜下层的细胞，每组计数4个视野。1．2．3．5流式细胞学技术检测转染前后BeWo细胞的凋亡变化1)用0．25％胰蛋白酶液充分消化转染48h后的空细胞组、空质粒细胞组、BeWoAP．2a细胞组，收集单细胞悬液，用预冷的PBS液洗涤细胞2次，2000rpm，离心5min，收集lxl05细胞；2)用0．25％胰蛋白酶液充分消化干扰96h后的空细胞组、BeWoAP2．asiRNAl细胞组，收集单细胞悬液，用预冷的PBS液洗涤BeWo细胞2次，经2000rpm36 第二部分：AP．2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究离心5min后，收集大约lxl05细胞；3)向其中加入500ulBindingBuffer悬液细胞；4)加入5ulAnnexinV—APC混匀后，加入5ul7-AAD染液，混匀：5)避光，室温反应10min；6)用流式细胞仪检测BeWo细胞凋亡情况。(红色荧光通过AnnexinV．APC通道，用FL4检测；红色荧光通过7-ADD通道，用FL3检测)。1．2．3．6AP一2a转染后对MMP．9、E—cadherin、Bax和Bcl一2表达的影响realtime．PCR方法检测：AP．2n载体转染BeWo细胞前后，MMP一9、E．cadherin、Bax和Bcl．2mRNA表达的变化，具体步骤同第一部分内容。Westernblot方法检测：AP．2ct载体转染BeWo细胞前后，MMP．9、E．cadherin、Bax和Bcl．2蛋白表达的变化，具体步骤同上。1．2．4AP．2asiRNA瞬时转染BeWo细胞AP．2ctsiRNA序列的选择，根据AP．2a基因序列，设计3对AP．2a．siRNA序列(见表1)，采用人工化学合成的方法，由广州瑞博生物技术有限公司完成合成。表1人工化学合成3对AlP．2a．siRNA序列siRNA序列号寡核苛酸序列1．2．4．1AP．2asiRNA瞬时转染BeWo细胞，实验分为四组组别干预因素空白细胞组转染AP．2asiRNAl细胞组转染AP．2asiRNA2细胞组转染AP—a2asiRNA3细胞组无转染AP一2asiRNAl转染AP．2asiRNA2转染AP．2asiRNA337 第二部分：AP一2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究1．2．4．2AP．2asiRNA瞬时转染BeWo细胞具体步骤如下：1)转染自仃3天，将对数生长期的BeWo细胞，用0．25％的胰酶消化，以2x105个／孔接种于6孔板，加入含有15％FBS的Ham’SF12培养液，当细胞达到40—50％融合时，即可以准备转染；2)转染当天，更换培养基为无血清的Ham’SF12培养液，每个培养孔加入800pl；实验分为3组，一组细胞转染AP．2asiRNAl，第二组转染AP．2asiRNA2，第三组转染AP一2ctsiRNA3，并设空白细胞作为对照组；3)用DEPC处理过的H20稀释siRNA，使siRNA干扰片段的终浓度调整为100nmol／L；采用siRNATransfectionReagent31al，按照转染试剂(“1)：siRNA(nmol／L)=3：100的比例，混合转染试剂和siRNA(AP．2ctsiRNAl、AP一2asiRNA2、AP．20【siRNA3)混合物，轻轻吹打，使其充分混合；4)将混合均匀的转染试剂．siRNA混合物，加入到6孔板中，5％C02、37℃培养12小时后，加入150lrtl血清；每次转染做三次重复；5)转染后48h、72h、96h观察细胞生长状况，并分别收集转染siRNA的BeWo细胞，realtime．PCR及WesternBlot的方法鉴定AP一2ct最佳siRNA抑制序列、最佳抑制时间。6)分别采用realtime．PCR及WesternBlot方法，分别检测转染前后MMP．9、E．cadherin、Bax和Bcl．2mRNA和蛋白的表达，具体操作步骤同前。1．3统计学分析采用SPSSl7．0系统软件进行处理数据，数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间数据进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，当差异有显著性意义时，使用LSD方法进行多个样本均数间的显著性检验，以Q=0．05为检验水准。38 第二部分：AP．2ct对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究2实验结果2．1AP．2aPCR扩增产物电泳分析结果AB2000bp1000bp250bp100bp图2．1AP一2aPCR扩增产物电泳分析结果A：AP一2aPCR扩增产物电泳条带；B：marker2000电泳条带；AP一2a基因扩增产物：1314bp2．2BamHI／EcoRI双酶切plRES2-EGFP的PCR产物电泳分析结果AB图2．2BamHI／EcoRI双酶切plRES2-EGFP鉴定结果A：DLmarker2000电泳条带；B：plRES2一EGFP电泳条带；其基因扩增产物：3kbp2．3重组质粒测序鉴定结果重组质粒pIRES2．EGFP／AP．20【抽提产物测序结果，见图2．3所示，经与GenBank序列比对，重组目的基因序列完全正确。39 第二部分：AP．20【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作州的研究其测序结果如下：渺黼j10汹f4蛐‰M胁舨枞j1．；唰燃端l㈧舭枞㈣．№㈧㈧黼㈣腧l黼燃‰l栅黔黼㈧轴黼i““㈣洲㈣‰k椭龇聃‰‰砒‰14kn5耐峨州‰舨‰4烈^k加扭m翩^khn地“KhA埘：nmo、』If矾，A州nn吣A_i≯n。j血f——0】：lJb，。／hf-‰，肌心，肌Ⅳ虮．厂、．：1{lm7Knn7)舛√∞出、∥噌瞬呲胁il№扩姚№№i|lll}1b4．矗机糯I腧‰螈胁‰蛳i|6，lI舢腩ll|l|I。☆黼№|1|l枞脯越．瓤k从懈胤‰黼‰№挑№M0^瓤肛小一胁如”缸赫．A脯耐k”．枞M钆¨‰MIm～胁t扎曲ff}kk肿，№慵‰M螂似k帆^m舳甜‰蚺f汕“。mK，，、。1k产h一。瓜n，、扎A0，一。^nA，Ⅵ^A卜^啊r、n||，-m_n／、，_r<0dI：，、r，、一J—nm．．越～、^—√＼^Id，、|，kdh^，、．n一一kn^图2．3真核表达质粒plRES2．EGFP／AP．2a测序图绿色部分为plRES2．EGFP载体部分序列；紫色为kozak序列。最好添加kozak序列，可增强表达。在真核细胞表达过程中，Kozak序列是保证目的基因转录产物能够被翻译的重要影响因素。黄色部分为AP．2a基因序列。TcAGATccGcTAGcGcTAccGGAcTcAGATcTcGAGcTcAAGcTTcGAATTc●lATGCTTTGGAAATTGACGGA，T、AATATCAAG‘rACGAGGACTGCGAGGACCGTCACGACGGCACCAGCAACGGGACGGCACGGTTGCCCCAGCTGGGCACTGTAGGTCAATCTCCCTACACGAGCGCCCCGCCGCTGTCCCACACCCCCAATGCCGACTTCCAGCCCCCATACTTCCCCCCACCCTACCAGCCTATC‘r'ACCCCCAGTCGCAAGATCCTTACTCCCACGTCAACGACCCCTACAGCCTGAACCCCCTGCACGCCCAGCCGCAGCCGCAGCACCCAGGCTGGCCCGGCCAGAGGCAGAGCCAGGAGTCTGGGCTCCTGCACACGCACCGGGGGCTGCCTCACCAGCTGTCGGGCCTGGATCCTCGCAGGGACTACAGGCGGCACGAGGACCTCCTGCACGGCCCACACGCGCTCAGCTCAGGACTCGGAGACCTCTCGATCCACTCCTTACCTCACGCCATCGAGGAGGTCCCGCATGTAGAAGACCCGGGl7ATTAACATCCCAGATCAAACTG11AATTAAGAAAGGCCCCGTGTCCCTGTCCAAGTCCAACAGCAATGCCGTCTCCGCCATCCC‘r’ATTAACAAGGACAACCTCTTCGGCGGCGTGGTGAACCCCAACGAAGTCTTCTGTTCAGTTCCGGGTCGCCTCTCGCTCCTCAGCTCCACCTCGAAGTACAAGGTCACGGTGGCGGAAGTGCAGCGGCGGCTCTCACCACCCGAGTGTCTCAACGCGTCGCTGCTGGGCGGAGTGCTCCGGAGGGCGAAGTCTAAAAATGGAGGAAGATCTTTAAGAGAAAAACTG 第二部分：AP一2ct对滋养细胞侵袋、增殖及凋亡作用的研究GACAAAATAGGATTAAATCTGCCTGCAGGGAGACG’rAAAGCTGCCAACGTTACCCTGCTCACATCACTAGTAGAGGGAGAAGCTGTCCACCTAGCCAGGGACTTTGGGTACGTGTGCGAAACCGAATTTCCTGCCAAAGCAGTAGCTGAATTTCTCAACCGACAACATTCCGATCCCAATGAGCAAGTGACAAGAAAAAACATGCTCCTGGCTACAAAACAGATATGCAAAGAGTTCACCGACCTGCTGGCTCAGGACCGATCTCCCCTGGGGAACTCACGGCCCAACCCCATCCTGGAGCCCGGCATCCAGAGCTGCTTGACCCACTTCAACCTCArrCTCCCACGGCTTCGGCAGCCCCGCGGTGTGTGCCGCGGTCACGGCCCTGCAGAACTA，rCTCACCGAGGCCCTCAAGGCCATGGACAAAATG‘I、ACCTCAGCAACAACCCCAACAGCCACACGGACAACAACGCCAAAAGCAGTGACAAAGAGGAGAAGCACAGAAAGTGAGGATCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGT2．4转染结果应用FUGENG-HD转染BeWo细胞48h，由于plRES2．EGFP／AP．2a质粒含有绿色荧光蛋白EGFP，因此，转染成功的细胞在荧光显微镜下观察细胞胞浆内可见到绿色的荧光，图2．4所示。图2．4荧光显微镜观察转染AP．2a质粒的BeWo细胞，(10×20)2．5质粒转染BeWo细胞内AP．2a表达效果的鉴定plRES2．EGFP／AP．2a真核表达质粒转染BeWo细胞48h、72h、96h后，经realtime．PCR检测BeWo细胞AP．2amRNA的表达，经统计学分析结果显示：与空质粒细胞组及空白细胞组相比，BeWoAP一2a细胞组在转染48h后AP．2amRNA的表达显著增高，(图2．5．1)；采用Westernblot方法检测转染48h三组BeWo细胞中AP．2a的蛋白表达，发现BeWoAP．2a细胞组中AP．2a的蛋白表达也最为显著(图2．5．2A．B)。故以plRES2．EGFP／AP．2a真核表达质粒转染BeWo细胞48h，作为后续实验的检测时间点。 第一二部分：AP一2ct对滋养细胞侵袋、增殖及凋亡作Hj的研究图2．5．1realtime—PCR检测BeWo细胞转染AP一20【真核表达质粒48h、72h和96h，AP．20【mRNA表达的变化realtime-PCR检测BeWo细胞转染AP一20【真核表达质粒48h、72h和96h，AP．20【转录水平的变化，以[3-actin作为内参，半与空质粒细胞组和空白细胞组比较，差异有统计学意义。123i．空白细胞组2．空质粒细胞组3．BeWoAP．2ct细胞绸Baction空白细胞组空质粒细胞组BewoAP2o细胞组图2．5．2Westernblot检测AP．20【真核表达质粒转染BeWo细胞48hAP．2a蛋白的表达A：Westernblot检测三组细胞AP-2a蛋白表达的电泳条带图；B：采用13-actin作为内参，定量分析图A中AP．20【蛋白表达的变化，以；±s表示，木与空质粒细胞组和空白细胞组比较，差异有统计学意义。2．6RNA干扰法下调BeWo细胞内AP．2a表达效果的检测我们用3种AP．20rsiRNA干扰片段，分别瞬时转染BeWo细胞48h、72h和96h，realtime—PCR方法检测AP．20【的抑制效果。经统计学分析结果显示：与空白细胞组比较，3种siRNA片段均可抑制AP．20【转录水平的表达，其中在转染96h后，BeWo细胞内AP一20【mRNA抑制效果最明显，故以转染96h作为后续实验的检测时间点(结果如图2．6．1所示)。42一●～ 第二部分：AP．2ct对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究用3种AP一2asiRNA干扰片段转染BeWo细胞96h后，提取细胞总蛋白，Westernblot方法检测AP．20【蛋白抑制的效果。经统计学分析结果显示：与空白细胞组相比，BeWoAP．2ctsiRNAl组中AP．2a蛋白的表达降低最为显著，故以AP-20csiRNAl片段作为后续实验的干扰片段(结果如图2．6．2A—B所示)。空白细胞组■BeWoAP．2txsIRNAl■BeWoAO．2aSiRNA2IIg盹WoAP．20tsiRNA31r■J1图2．6．1realtime—PCR检测BeWo细胞转染3种AP一2asiRNA48h、72h、96h，AP．2ctmRNA表达的变化，以13-actin作为内参，其中在转染96h，BeWoAP．2ctsiRNAl组中AP．2ctmRNA抑制效果最明显，术与空白细胞组比较，差异有统计学意义，P<0．05。A1．空白细胞组2．BeWoAP．2ctsiRNA1组3．BeWoAP．2ctsiRNA2组4．BeWoAP一2ctsiRNA3组AP．2ct6一actin萋。：!Illllll‘8ewn49·2Ⅱ鲥8NA3组图2．6．2Cwesternblot检测BeWo细胞转染AP一2ctsiRNA3个片段96h后AP一2ct蛋白的表达A-Westernblot方法检测AP-2ctsiRNAl干扰96h后，BeWo细胞中AP．2ct蛋白表达的条带图。c：采用[3-actin作为内参，定量分析图B中各蛋白表达的变化，以；±J表示，}与空白细胞组比较，差异有统计学意义，P<0．05。43208642O。，coInneA蔷宝|le暮至z￡蛳一一b 第二部分：AP．2C【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作刚的研究2．7AP．2a对BeWo细胞侵袭能力的影响BeWo细胞经plRES2一EGFP／AP．2a转染后，Transwell侵袭实验结果显示：BeWoAP一2a细胞组、空质粒细胞组和空白细胞组的穿膜细胞数分别为：53．25士13．94、132士16．35和156+25．65。采用方差分析结果显示：三组之间差异有统计学意义，进一步利用LSD方法进行两两比较，与空质粒细胞组和空白对照组相比，BeWoAP．2a细胞组穿膜细胞数明显减少，差异有统计学意义(见图2．7A．B)。莒更’_i三兰8o善三空质粒细胞组BeWoAP．2a细胞组A空白细胞组空质粒细胞组BeWoAP2a细胞组B图2．7转染AlP．2a真核表达质粒对BeWo细胞侵袭能力的影响0O0O0加懈埔M挖加8642 第二部分：AP．2ct对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究2．8AP．2a对BeWo细胞增殖能力的影响plRES2．EGFP／AP一20c质粒转染Bewb细胞后，每隔12h，用MTT比色法测定吸光度值，并根据所测的数据，描绘出细胞增殖曲线，如图2．8所示。经重复测量方差分析显示随着时间推移，plRES2一EGFP／AP．2a质粒转染BeW6细胞，其细胞增殖率与空质粒细胞组及空细胞组无显著差异俨均>0．05)。图2．8转染AP一2a真核表达质粒对BeWo细胞24h、36h、48h和72h细胞增殖率的变化2．9AP．2a对BeWo细胞凋亡的影响在细胞凋亡早期，细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内移至细胞膜外，AnnexinV是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS特异性结合，用荧光素APC标记的AnnexinV作为荧光探针，与核酸染料7-AAD联合应用，采用AnnexinV／7．AAD双参数法，经流式细胞仪检测细胞凋亡，可将细胞分为：AnnexinV‘／7．AAD’(表示活细胞，位于左下象限)，AnnexinV+／7．AAD。(表示早期细胞凋亡，位于右下象限)，AnnexinV／7．AAD+(死细胞，左上象限)，AnnexinV+／7．AAD+(晚期细胞凋亡，右上象限)。AnnexinV+／7．AAD一和AnnexinV+／7．AAD+占总细胞的百分比，即为细胞的总凋亡率。观察到AP．2a促进BeWo细胞凋亡。采用方差分析结果显示：三组之间差异有统计学意义，进一步利用LSD方法进行两两比较，与空细胞组和空质粒细胞组相比，BeWoAP．2a细胞组中BeWo细胞凋亡率显著增高；采用AP．2asiRNAl瞬时转染BeWo细胞后，可减少BeWo细胞凋亡的发生率，与空细胞组相比，BeWoAP．2asiRNAl细胞组细胞凋亡显著减少(火0．05)。(结果见表3．4，图2．945 第二部分：AP一20【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作月j的研究A—E所示)表3AP．2a真核表达载体转染BeWo细胞48h后三组细胞凋亡率结果(X±S)组别BeWo细胞凋亡率(％)A：空白细胞组B：空质粒细胞组C：BeWoAP．2a细胞组9．32土O．9910．76士0．6714．88土1．15幸注：与空细胞组和空质粒细胞组比较，木差异有统计学意义；空细胞组和空质粒细胞组比较，P>0．05。表4AP．2asiRNAl干扰BeWo细胞96h后两组细胞凋亡率结果(X±S)组别BeWo细胞凋亡率(％)D：空白细胞组E：BeWbAP．2asiRNAl细胞组8．90士0．324．49-a：0．48*注：与空细胞组比较，木为P<0．05，差异有统计学意义笙冬至“要2星乙A9．01％D飞n笙2多“鼍21名一冬a2《：'cV毫2重飞oaB飞●，呈2j～复拿差毛3．99％E7‘ADD图2．9AP-2a对BeWo细胞凋亡作用的影响A：空细胞组；B：空质粒细胞组；C：BeWoAP．2a细胞组。与空细胞组、空质粒细胞组细胞凋亡率相比(9．32+0．99％；10．76+0．67％)，BeWoAP．2a细胞组的细胞凋亡率显著增加(14．88+1．15％)，而空细胞组和空质粒细胞组凋亡率没有差异性，P>0．05。D：空细胞组；E：BeWoAP．2asiRNAl细胞组。与空细胞组细胞凋亡率(8．90-J：0．32％)比较，BeWoAP．2asiRNAl细胞组细胞凋亡率(4．49-土：0．48％)显著降低，P<0．05。 第二部分：AP．20【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作州的研究2．10AP．2a质粒瞬时转染对BeWo细胞内Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP．9表达的影响plRES2．EGFP／AP．2d质粒转染BeWb细胞48h时，realtime．PCR方法检测BeWo细胞内，Bax、Bcl一2、E—cadherin和MMP．9mRNA的表达变化，经统计学分析结果显示：与空质粒细胞组、空细胞组比较，转染BeWoAP．20c细胞组中，E—cadherin和BaxmRNA的表达显著增高，而MMP．9和Bcl一2mRNA的表达显著被抑制，如图2．10A所示。Westernblot方法检测BeWo细胞中，Bax、Bcl．2、E—cadherin和MMP．9蛋白的表达，与空白细胞组、空质粒细胞组比较，BeWoAP．20【细胞组内E—cadherin和Bax的蛋白表达显著增加，而MMP．9和Bcl．2的蛋白表达则显著降低，如图2．10B．C所示。。109；空质粒细胞组。。6、‘⋯BeWo—AP-葫瞻组篷羞——簟‘奠I簟簟I謦ll朗x。1一．---．．．．．———-E-cadhcrinB～．。MMP—u————_—●————●一阳ction卒门舅{|H也组。j。质十i纠1胞纠【BcWoAP一2u纠【陆叶2￡q叠耐_m球图2．10AP．2a转染48h，BeWo细胞中Bax、Bcl．2、E．cadhefin和MMP．9mRNA及蛋白表达水平的变化A：realtime．PCR分析AP．2a转染48h，BeWb细胞中Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP．9mRNA表达水平的变化，以13-actin作为内参，*Lj空质粒细胞组和空白细胞组比较，差异有统计学意义。B：Westernblot方法检测AP．2u转染48h后，BeWo细胞中Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP．9蛋白表达的条带图。C：采用13-actin作为内参，定量分析图B中各蛋白表达的变化，以；±s表示，拳与空质粒细胞组和空白细胞组比较，差异有统计学意义。47 第二部分：AP．2ct对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究2．11AP．20tsiRNA瞬时转染对BeWo细胞内Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP．9表达的影响为了进一步说明AP．20【与Bax、Bcl一2、E．cadherin和MMP．9的相关性，本研究通过干扰AP．2a表达，并瞬时转染BeWo细胞，用realtime．PCR和Westernblot的方法，检测Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP．9mRNA和蛋白的表达量。realtime．PCR结果表明，AP一20tsiRNAl转染96h后，BeWo细胞中Bax和E．cadherinmRNA的表达明显下降，而Bcl．2和MMP．9mRNA的表达则显著增加，P<0．05(图2．11A)。Westernblot结果显示，AP．2ctsiRNAl转染96h后BeWo细胞Bax和E．cadherin蛋白表达显著被抑制，而Bcl一2和MMP．9蛋白的表达则显著增加，P<0．05(结果见图2．11B．C所示)。BaxBcl一2Ci---im审白细胞组BeWoAP．2siRNAl组．空白细瞧组BeWOAP·2asiRN^1细咆组．。1图2．1lAP．2asiRNAl干扰96h时，BeWo细胞中Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP-9mRNA及蛋白表达水平的变化A：realtime．PCR分析AP．2ctsiRNAl干扰96h时BeWo细胞中Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP．9mRNA表达水平的变化，以13-actin作为内参，幸与空白细胞组比较，P<0．05。B：Westernblot方法检测AP．2asiRNAl干扰96h后，BeWo细胞中Bax、Bcl．2、E．cadherin和MMP．9蛋白表达的条带图。C：采用13-actin作为内参，定量分析图B中各蛋白表达的变化，以一X±s表示，乖与空白细胞组比较，P<0．05。■■■■■■■■■_附：-№■■●_叭：呈¨!璺¨晒们叫¨嘣o765I3010SlI，昱詈．塞薯1．JvN鼍A 第二部分：AP．2伍对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究3讨论人类胎盘绒毛表面覆盖着绒毛滋养细胞，包括细胞滋养细胞(ctotrophoblas，CTB)和合体滋养细胞(syncytiorophoblast，STB)，细胞滋养细胞有丝分裂活跃，形成新的滋养细胞，新滋养细胞膜消失、融合形成合体滋养细胞【21。CTB和STB共同承担着母儿问的营养物质、气体交换及分泌多种激素和细胞因子等功能。适当数量的滋养细胞侵袭子宫蜕膜及子宫肌层，改变了子宫螺旋动脉的结构，可使胎盘获得充足的血流量，从而为维持正常胎儿的发育，提供了保障【3】。一旦妊娠早期滋养细胞侵入不足，胎盘植入过浅，就可能发生病理妊娠，如：子痫前期、胎儿宫内发育迟缓等。而在这一过程中，蛋白水解酶及钙粘连蛋白起着重要的作用。既往研究【4J已经发现，母胎界面E—cadherin、基质金属蛋白酶(MMPs)、整合素粘附分子等参与降解细胞外基质，是滋养细胞侵袭的关键因素，但它们受何种因素调控，目前国内外尚未阐明。细胞凋亡即是机体清除有害物质的重要现象，同时它也是病理过程发生、发展的重要标志l51。同样地滋养细胞发生凋亡在胎盘形成和发育过程中，也起着重要的调节作用，其中Bcl一2家族是参与滋养细胞凋亡的主要执行者，但它们受何种因素的调控，目前尚未阐明。早期妊娠，胎盘细胞很少发生凋亡，随着妊娠进展，有胎盘细胞凋亡率增加的现象I州。比如Mayhewl7j等的研究，发现在妊娠中期，适度地滋养细胞凋亡可保证滋养细胞层的『F常厚度，有利于母胎间营养、气体等的交换。李小毛【8】等利用TUNEL和电镜的方法，发现妊娠晚期，滋养细胞大量凋亡，可能与分娩发动和产程进展有关。但是一旦在早期妊娠胎盘滋养细胞发生过度凋亡，一方面能够引起侵入母体螺旋动脉的滋养细胞数量减少，螺旋动脉不能有效地扩张；另一方面又能减弱滋养细胞的侵袭能力。滋养细胞侵袭减少及母体螺旋动脉不能正常改建，形成低阻高容的血管，就可导致胎盘缺氧、供血不足，而诱发子痫前期的发生。3．1AP．2a对滋养细胞侵袭力的影响AP．20r是核转录因子，通过与其下游基因启动子或增强子结合，转录性上调或抑制其下游基因的表达，参与细胞增殖、分化、运动和细胞间的联系等，如下游基因：p21WAFl／CIPl、CerB．2、E．cadherin、MMPs、c-myc等。在乳腺癌细胞内，通过siRNA阻断AP．20【基因的表达，发现乳腺癌细胞凋亡率明显降低，AP-2a下调Bcl一2的表达，并利用Bax／cytochromec／Apafl(apoptosisprotease49 第二部分：AP一20【对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究activationfactor．11／caspase9依赖的线粒体通路，诱导肿瘤细胞凋亡【9J。依据上述理论，为了深入探讨AP．20c的高表达可能在子痫前期的发生发展中起着作用，我们本部分课题采用体外研究，成功构建AP．2Q真核表达载体，首次瞬时转染滋养细胞来源的BeWo，从蛋白水平及基因水平，检测其下游靶点E—cadherin、MMP．9、Bax和Bcl．2的表达变化，及对滋养细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。本实验采用非病毒载体质粒plRES2一EGFP，它是大小为5．3kb的真核表达载体，采用的报告基因是海洋生物维多利亚水母绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)，可自身催化形成荧光基团，在荧光显微镜下显示为绿色荧光11⋯。真核表达质粒plRES2．EGFP基因结构上，存在MCS多克隆位点，并且在MCS和EGFP之问，有内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IRES)，在IRES位点，插入AP．2仅目的基因片段后，从而，使得AP．2a与EGFP基因转录成一条mRNA，但AP．20【与EGFP却以不同的机制，翻译成独立的肽或蛋白【11，121。经过BamHI和EcoRI双酶切plRES2．EGFP质粒载体，使得该质粒载体与AP．20【基因发生线性连接，形成融合蛋白，这即可以定量检测该载体的转染、表达效率，又能更好的跟踪AP．20【基因的表达。我们参考GenBank登录的AP．2{t基因的全长cDNA序列，设计引物，采用realtime—PCR技术，从胎盘组织cDNA文库中，扩增出AP．2仅全长cDNA，大小为1314bp，设计引物时，在AP．2仅上下游两端，分别加入BamHI和EcoRI双酶切位点，定向克隆到plRES2．EGFP真核表达载体，经测序分析，克隆AP．2a全长基因序列是完全『F确的，证明本实验已成功构建plRES2一EGFP／AP一2a真核表达载体。为下一步研究AP一2仅对BeWo细胞生物学性状及下游基因表达的影响，打下了很好的基础。根据本部分课题研究结果提示，AP．20c能够上调BeWo细胞中E．cadherin的表达，下调MMP．9的表达，同时伴随着滋养细胞侵袭数量减少，凋亡率增加，但细胞的增殖率没有发生明显差异。MMP．9是锌依赖性内源性蛋白水解酶，它的主要作用是参与降解细胞外基质和基底膜，从而影响滋养细胞的侵袭能力。MMP一9分子量为72KD，它的基本结构主要包括信号肽、前肽区和催化区，是由10个外显子和9个内显子组成，其中催化区有两个zn2+结合区，对酶的活性起着重要的调节作用【1引。MMP．9基因受多种因素转录性调控，其中如：IL．1，．2、EGF、TNF、TGF、PDGF等均能上调MMP．9的表达；而TGF．B、类固醇激素(包括糖皮质激素)和视黄醛及AP．2ct则转录性下调MMP．9的表达【14】。滋养细胞类似于肿瘤细胞，具有侵袭行为，但又不同于肿瘤细胞的失控性生长，它只 第二部分：AP．2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究在特定的时空发生，滋养细胞仅仅侵入到子宫蜕膜和近1／3子宫肌层，这主要因为滋养细胞侵润过程受MMPs及TIMPs和E—cadherin等的精确调控，当这一动态平衡被打破，就会发生滋养细胞侵袭过浅j如发生子痫前期、流产、早产等；或者滋养细胞侵袭过深则发生胎盘植入、绒毛膜癌等。当妊娠4周时，在绒毛外滋养细胞和血管内皮细胞中，MMP．9是高表达的，因为它是滋养细胞侵入蜕膜内皮的主要参与者，同时也是血管重建及生成的主要参与者【15】。武卫平【16】等也发现，在中问滋养细胞和合体滋养细胞中，MMP．2，．9和TIMP．1，．2均有表达，而在胎盘着床位置的滋养细胞中，仅见到MMP．9的表达，以上这些现象说明，MMP．9与滋养细胞侵润、细胞间质的水解及胎盘血管网形成有关。研究还发现Il7|，胎盘细胞凋亡常常多发生在母胎界面顶端的细胞处，这也是MMP．9聚集的位置，提示MMP．9对此处细胞外基质的降解的同时可能也诱使蜕膜细胞发生凋亡，这有利于绒毛分支的形成。LiuG118J等采用原位杂交等方法发现，细胞表面的糖蛋白E．cadherin，能通过降低MMP．2和MMP一9的表达及活性，可使孕鼠子宫内胚胎着床过程受到阻碍。KotaniT等【”】体外培养HTR／8neo滋养细胞，发现AP．2a能下调MMP．2和MMP．9的基因的表达，从而降低滋养细胞的侵袭能力。在第一部分实验中，重度子痫前期胎盘滋养细胞及绒毛膜外滋养细胞，AP．2a的表达增加，而MMP．9的表达减少；而本部分研究，通过体外培养滋养细胞BeWo，采用plRES2一EGFP／AP．2a真核表达载体，瞬时转染Bewb细胞，不仅仅引起滋养细胞侵袭细胞数量减少，而且抑制MMP一9mRNA和蛋白的表达，这一现象与以往研究结果相符合，说明AP一20t可通过转录性下调MMP一9的表达，起到降低滋养细胞侵袭能力的作用。钙粘连蛋白是Ca2+依赖的介导同源细胞间相互粘附的多基因家族成员。到目前为止，已经发现有100多种钙粘连蛋白家族成员，其中E．cadherin是研究最为透彻的钙粘连蛋白，是由高度保守的胞内结构域和含有5个钙粘蛋白重复区(ECl．EC5)的胞外结构域组成，它们具有相似的结构及生物学功能，如：促进细胞．细胞间的粘附，利用自身配体介导同源细胞的粘附和聚集，维持正常组织的完整性。当E．cadherin功能或表达缺失时，可减弱细胞粘附的强度，并导致细胞活动性增加，允许肿瘤细胞穿透基底膜，并侵袭到周围组织中，即发生肿瘤细胞转移现象，所以E．caherin作为肿瘤抑制因子，与肿瘤的发展和转移密切相判201。另外，在关于乳腺癌免疫组织化学方法的研究【21】，与侵润性导管癌相比，大部分侵润性乳腺小叶癌中的E．cadherin蛋白表达明显减少或消失，E．cadherin51 第二部分：AP．20L对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究的表达减少或者缺失，均与肿瘤细胞的高侵袭及低分化有着紧密的联系。当E．cadherin表达减少或丢失时，细胞间的相互粘附力就会降低，细胞容易分散，并向外周发生侵袭，从而发生远处转移【22】。E—cadherin还能抑制肿瘤细胞等产生MMPs，从而，阻止肿瘤细胞周围基质和基底膜中的各种蛋白成分发生降解¨引。在侵袭性葡萄胎和绒毛膜癌等妊娠滋养细胞疾病的研究中发现【241，E．cadherin的表达减少或缺失，可导致滋养细胞粘附功能减弱或消失，从而，引起滋养细胞转化为高度侵袭性的表型。E．cadherin的适量表达与滋养细胞的生长、发育进展有关，妊娠早期，任何部位的滋养细胞表面均有E．cadherin的粘附和表达，这有利于胚胎的粘附与植入【25】；然而，随着孕周的增加，E．cadherin在绒毛的表达逐渐减少，这可能有利于滋养细胞侵润蜕膜及子宫肌层，当封闭E—cadherin可以显著提高滋养细胞的侵润能力。Pang[26】等发现在子痫前期胎盘组织的细胞外基质中，E．cadherin、整合素、选择素基因表达均显著增高，而潘瓷Iz7】等也发现，重度子痫前期胎盘滋养细胞E．cadherin异常表达，滋养细胞侵润能力降低，不能由上皮表型拟合形成侵润表型，导致滋养细胞侵润受阻，形成胎盘浅着床和胎盘缺血、缺氧等病理表现【281。GiuseppeEPontoriero纠29】利用比较微阵列数据分析得出，在鼠晶状体突变缺失AP．2仅表达后，可显著减少E．cadherin基因及蛋白的表达。这是因为在一些不同的上皮细胞系，包括眼晶状体细胞中，AP．2Ⅱ可通过直接结合E—cadhefin的启动子，而调节它的表达；当AP．2a缺失时，可引起受累组织中E．cadherin表达的减少。在含有高比例的AP．2Q斗细胞的嵌合体小鼠的日艮球表面的组织区域中，也检测到E．cadherin染色减少；发育的目镜中异位表达AP．20r，可以引起E—cadhern蛋白在品状体移行带区域表达扩增，这是上皮细胞终末分化成纤维细胞的区域，从而，也说明E．cadherin可能是AP．20【转录性调节的下游靶点【3叭。既往研究也发现⋯，在角膜上皮细胞过表达AP．20L，结果可上调N．cadherin蛋白的表达。在鸡N—cadhedn基因启动子区域中，发现可与AP．2Q结合的共有序列[32J。关于上皮细胞向问质细胞转化(EMT)的研究中f33】也发现，视网膜母细胞瘤(Rb)在上皮细胞中，控制细胞与细胞之间的粘附，是通过AP．2a正向转录性调节E．cadherin的表达而实现的。以上这些研究，均提示钙粘连蛋白家族的多个成员是AP一20【的下游靶点，AP一20【通过与它们的启动子或增强子结合，而转录性调控它们的表达。在这研究中，我们分析了AP．2a与E．cadherin和MMP．9之间的关系，并观察了AP．2a对滋养细胞侵袭力的影响。研究结果显示：AP．2a过表达可引起BeWo52 第二部分：AP．2a对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究细胞中E—cadherinmRNA和蛋白的表达显著增加；MMP．9mRNA和蛋白的表达显著降低，同时伴随着滋养细胞的侵袭数量明显减少，当我们干扰AP一2a表达时，发现E—cadherin的表达也随之降低，而MMP一9的表达却增加，同时检测滋养细胞侵袭力增强的现象，这一结果进一步证明了，AP．2a通过转录性上调E．cadherin和下调MMP．9的表达，对滋养细胞的侵袭行为起着负调控的作用，同时E．cadherin也参与下调MMP．9的表达，增加细胞间的粘附作用，抑制细胞外基质的降解，最终导致胎盘浅着床的发生。3．2AP．2a对滋养细胞凋亡的影响Bcl．2基因即B细胞淋巴瘤／白血病一2基因(B—celllymphoma／Leukemia2)，是从人滤泡性淋巴瘤中t(14；18)染色体易位的断裂点位置克隆得到的，是第一个被发现能抑制细胞凋亡的原癌基因，它的C端含有1个19个氨基酸组成的疏水跨膜区，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡的作用，Bcl．2在细胞内表达增加，可抑制多种因子诱发细胞凋亡，从而，起到延长细胞寿命的作用p4|。Bax是最早发现的促凋亡因子，是Bcl．2的同源类似物，Bax主要定位于细胞浆，但在线粒体表面也有部分Bax的表达。Bcl．2／Bax通过形成二聚体的形式，发挥调控细胞凋亡的作用，当Bcl．2表达占优势时，可以形成Bcl．2／Bax异源二聚体，起到抑制细胞凋亡的作用；而Bax基因表达增多时，形成Bax同源二聚体较多，则引起线粒体通透性增加，释放细胞色素C，激活大量caspase级联反应，从而执行细胞凋亡活动【”J。整个妊娠过程中的各种滋养细胞、问质细胞都有Bcl．2和Bax的表达，而且Bax／Bcl．2的比值，随着妊娠的进展而增加，提示滋养细胞凋亡在妊娠晚期的增加，与Bax／Bcl．2的比值增加有关。CoelhoTM【36】等研究发现，胎盘滋养细胞、蜕膜细胞和间质细胞中，均有Bax表达，而且与正常足月胎盘组织细胞比较，Bax在子痫前期中的表达显著增高。既往研究曾【37】iiE实，子痫前期患者合体滋养细胞中，Bcl．2的表达与细胞凋亡率呈负相关，提示Bcl．2参与子痫前期滋养细胞的凋亡。本研究第一部分结果已显示，在重度子痫前期胎盘绒毛滋养细胞、绒毛外滋养细胞中Bax的表达显著增加，而Bcl．2的表达则显著减少，这和既往研究结果一致，说明Bax和Bcl．2参与子痫前期细胞凋亡的发生过程。越来越多的证据显示：AP．2c【参与细胞凋亡的调控。COPD[38】和人乳腺癌【391等的研究中发现，AP．2a的表达增加，可起到促进细胞凋亡的作用。AP．2a可通53 第二部分：AP．20L对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究过直接结合Bcl．2启动子．48到．39氨基酸位点，即：5'-CTCTCCCCGC-3’，而转录性抑制Bcl一2基因的表达；同时AP．2a又可改变Bax的转录，使Bax的N端和疏水区C端发生构象改变，使其移位至线粒体外膜，并利用Bax／细胞色素C／Apafl／caspase一9依赖的线粒体凋亡途径，而发挥促进细胞凋亡的作用㈣J。在临床研究部分，我们发现重度子痫前期组胎盘组织中AP．20【和Bax表达均增高，Bcl．2的表达则显著降低。为了进一步研究AP．2q与Bax、Bcl．2的关系，我们通过过表达BeWo细胞中AP．2a的表达及阻断AP．20【的表达，利用realtime—PCR和Westernblot方法，检测Bax和Bcl．2mRNA和蛋白的表达，并采用流式细胞技术，观察BeWo细胞凋亡的变化，其结果显示为：AP．2Q过表达促进Bax的表达，抑制Bcl．2的表达，并观察到BeWo细胞凋亡率增加。当AP一2asiRNA阻断BeWo细胞中AP．2cL的表达时，研究发现Bax的表达下调，Bcl．2的表达上调，同时BeWo细胞凋亡率减少。这些结果表明，AP．2a通过转录性调控Bcl．2和Bax的表达，扳动了滋养细胞凋亡的丌关。总之，我们首次论证了在BeWo细胞中，AP。2u通过转录性上调E．cadherin和反式调控MMP．9的表达，对滋养细胞的侵袭行为起着负调控的作用，从而抑制了细胞外基质的降解；同时AP．20t又通过转录性调控Bcl一2和Bax的表达，诱发滋养细胞发生过度凋亡，最终导致胎盘浅着床的发生。关于AP．2cL参与子痫前期发病机制的研究刚刚起步，今后需要稳定转染技术及转基因技术，进一步研究AP．2ct与其下游各种相关基因之问的关系，为子痫前期的诊治提供新的思路。54 第二部分：AP．20L对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作_}_fj的研究4小结4．1首次构建plRES2一EGFP／AP一2a真核表达载体，并成功转染人绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞；4．2体外研究证实，转录因子AP．2ct通过转录性调节滋养细胞中E．cadherin和MMP．9的表达，起到抑制滋养细胞侵袭力的作用；4．3转录因子AP一2a调控滋养细胞中Bax和Bcl．2的表达，起到促进滋养细胞凋亡的作用。55 第二部分：AP．2u对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究参考文献【1】【2】【3】【4】【5】【6】【7】【8】【9】【10】【11】【12】【13】【14】KhooNK，S，BechbergerJF,ShepherdT，eta1．SV40TagtransformationofthenormalinvasivetrophoblastresultsinapremalinantphenotypeI．Mechanismsresponsibleforhyperinasivenessandresistancetotheanti—invasiveactionofTGF-13[J]．IntJCancer，1998．77：429．张丽娟，刚敏，丁依玲．TGFpI，Bcl．2与妊娠期高血压疾病胎盘细胞凋亡的关系．JCentSouthUniv(MedSci)，2007，32(5)：883—889．BullaR，BossiF’TedescoEThecomplementsystematthMolecularandCellularBiochemistryeembryoimplantationsite：friendorfoe?[J]．FrontImmunol，2012，3：55．WhitleyGS，CartwrightJE．Cellularandmolecularregulationofspiralarteryremodeling：lessonsfromthecardiovascularfield[J]．Placenta，2010，31(6)：465—474．HaradaT，TaniguchiElzawaM，eta1．Apoptosisandendometriosis[J]．FrontBiosci，2007，12：3140—3151．RayJ，JurisicovaA，CaniggiaI．IFPATrophoblastResearchAwardLecture：thedynamicroleofBcl一2familymembersintrophoblastcellfate[J]．Placenta，2009，30(SupplA)：$96-100．MayhewTM，BurtonGJ．MicroscResTechn．Stereologyanditsimpactonourunderstandingofhumanplacentalfunctionalmorphology[J]．MicroscResTech，1997，38(1-2、：195—205．李小毛，沈慧敏，侯红瑛等．关于临床前后胎盘与胎膜中细胞凋亡的研究【J】．中华围产医学杂志，2000，(2)：71．73．WajapeyeeN，BrittoR，RavishankarHM，SomasundaramK．ApoptosisinductionbyActivatorProtein2ctinvolvestranscriptionalrepressionofBcl一2【J】．JBiolChem，2006，281(24)：16207—16219．SkillmanLC，SutherlndLW,JonesM，eta1．Greenfluorescentproteinasnovelspecies-specificmarkerinentericdualsecicesbiofilms【J】．Microbiology,1998，144：2095-2101．杨天燕，王乃平，王劲等．构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体Plxsn—Kozak—EGFP及鉴定【J】．中国组织工程研究与临床康复，2010，14(37)：6908—6912．MartinezEC，WangJ，GanSU，eta1．Ascorbicacidimprovesembryoniccardiomyoblastcellsurvivalandpromotesvascularizationinpotentialmyocardialgraftsinvivo[J]．TissueEngPaPA，2010，16(4)：1349—1361．EstellaC，Herrerl，AtkinsonsP,eta1．Inhibitionofhistonedeacetylaseactivityinhumanendometrialstromalcellspromotesextracellularmatrixremodelingandlimitsembryoinvasion[J]．PLoSOne，2012，7(1)：e30508．Staun—RamE，GoldmanS，ShalevE．Ets一2andp53mediatecAMP—inducedMMP一2expression，activityandtrophoblastinvasion[J]．ReprodBiolEndocrinol，2009，7：135．56 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全文结论1．2．本研究体内实验揭示AP．2ct及E．cadherin、MMP．9、Bax和Bcl．2在重度子痫前期胎盘组织中异常表达。首次构建plRES2．EGFP／AP．2仅真核表达载体，并成功转染人绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞，与体内研究结果一致，体外研究进一步证实，ALP．2ct通过转录性调节滋养细胞中E．cadherin和MMP．9的表达，起到抑制滋养细胞侵袭力的作用，为进一步阐明滋养细胞侵入不足与子痫前期发病的关系，提供了参考的理论依据。体外研究首次证实，AP．2ct通过转录性调节滋养细胞中Bax和Bcl．2的表达，起到促进滋养细胞凋亡的作用。结合体内研究结果，为进一步深入探讨和阐明AP．2a与子痫前期细胞过度凋亡的关系，提供了可靠依据，同时也为子痫前期发病机制的研究，提供一个新的研究方向。59 综述一转录因子AP．2q研究进展张玲张展综述审校1转录因子ALP．2仅的结构及作用机制1987年由MITCHELL等首次从Hela细胞分离出转录因子AP．2，哺乳动物AP一2家族有5个成员，它们分别是AP．2q、AP部、AP．却、AP．26和AP．2￡【1|。AP一2具有“basic—helix．span—helix”的特殊性DNA结合和二聚体基序(motif)结构，AP一2家族成员可以同源或异源二聚体的形式，结合到富含GC的元件上，其中最为典型的共有序列是：5'-GCC—NNNGGC．3’12J。AP．20‘位于人类染色体6p24，由437个氨基酸组成，分子量为52kDa，它可以结合3个相关序列的基序，分别是：GCCN3GGC，GCCN4GGC和GCCN3／4GGGt引。在许多重要生物学功能的基因序列上，都有AP．2仅结合位点。目前，在胰腺癌的研究中I4|，已经发现AP．20【有6个突变体，AP．20r及其突变体均在胰腺癌组织中表达，其中，AP．2Q突变体6是在AP．2Gt外显子上有一个隐性的剪接，形成较短的激活区域，虽然它的DNA结合区域是完整的，但它通过与全长AP．20r形成二聚体，而起到显性失活的作用，或者仅仅通过阻断AP．20【反应元件，阻断靶基因与AP．20【全长的结合，从而，达到阻止特殊靶基因的转录激活。AP．2c【作为重要的核转录因子，当AP．2a的激活区和功能区结构完整，AP．20【结构上有下游靶基因启动子或增强子的结合位点时，AP．2a就可以转录性调控下游靶基因，参与细胞生命活动(包括：细胞凋亡、细胞生长及分化等)及胚胎发育、肿瘤发生、发展过程。AP．2a调节下游基因转录的激活，目前已经发现，有三种途径，它们分别是：一、通过依赖于cAMP的蛋白激酶A途径，二、通过佛波酯(phorbolester)／-酸甘油(diacylylycer01)诱导的蛋白激酶C途径，三、通过视黄酸途径【5J。目前，关于AP．2仅通过蛋白激酶A途径介导的下游靶基因转录激活的机理，研究的已经相对较清楚，如AP．2a可以通过与apoE基因启动 综述一子上的结合位点结合后，对cAMP的激活起着调节作用。一旦当AP．2a结合位点发生突变时，将在很大程度上降低cAMP对apoE基因的激活作用16J。另有研究发现，cAMP激活的蛋白激酶A又能使AP．20【的丝氨酸239位点上发生磷酸化，这种磷酸化虽然不能改变AP．2a在体外对结合位点的结合能力，但能在细胞中起到增强AP．2a对基因启动子的激活作用。从而研究得出，磷酸化作用可能是活化AP．2a的原因之一。2AP．2a在肿瘤中的作用2．1AP．2a在黑色素瘤中的作用黑色素瘤的发生及发展，经历了一系列的连续过程：从黑色素细胞到良性痣、黑色素瘤早期放射状生长阶段、黑色素瘤垂直生长阶段，最后发展成恶性转移I_刀。在转移性黑色素瘤细胞系和临床标本肿瘤细胞中，AP．20【的表达减少或缺失18J。AP．2晓表达的缺失又引起一些细胞因子表达的异常，如：c．KIT，MCAM／MUCl8，HER．2，VEGF，MMP．2和凝血酶受体PAR．1，促使黑色素瘤细胞发生恶性转移pJ。而PAR．1的激活又引起IL．8、PDGF和VEGF等与血管发生有关基因的表达及分泌，加速肿瘤细胞恶性转移的程度。最近研究【10】也表明，在黑色素瘤中PAR．1还调节肿瘤抑制剂基因的表达，如：乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)。在黑色素瘤中，CREB表达上调与黑色素瘤细胞从早期放射状生长阶段向垂直生长阶段转化有关。染色质免疫沉淀法分析发现CREB可与AP一2a启动子结合。CREBshRNA增加AP一2a的启动子活性，而在CREB沉默的细胞，通过恢复CREB的表达，可上调AP．2a的表达111】。Pennall2】等研究证实了，miR．214可作为AP．2a转录后调节剂，调节AP．2a的表达，从而促使黑色素瘤发生转移。据此推测，转录因子AP．2a及其上游信号与不同的转录因子之间的交互作用，在恶性肿瘤的发生及发展中，起着决定性的作用。2．2AP-2a在胰腺癌中的作用胰腺组织的免疫组化结果分析【”1，非肿瘤导管细胞和内分泌细胞，均表达大量的AP．2Q，而胰腺导管腺癌细胞仅仅表达5．5％的AP．2a，AP．2a表达丢失，与胰腺癌的发生相关。当克隆稳定高表达AP．2a的胰腺细胞系CAPAN．1，AP．20【的过表达，可引起上皮粘蛋白4(MUC4)基因表达下调及CDK抑制剂p27kipl61 综述一表达上调114J。MUC4基因表达的减少，反过来，又能促使AP．2Q发挥促凋亡的作用，同时又可上调CDK．1p27kipl、p57kip2和p21cipl的表达，从而启动由AP．2Q过表达，引起的G1期停滞的细胞周期(细胞周期调控基因：p27kipl可通过阻断细胞周期，而起到抗肿瘤活性的作用)。AP．2a通过直接结合和反式激活p27kipl的启动子，而诱导p27kipl蛋白的表达，同时，AP．2a过表达又可以增加CAPAN．1细胞对低剂量吉西他滨化疗药的敏感性，并且减少胰腺癌细胞的迁移能力1151，这个效应可独立于p53而发挥作用，并引起Bcl．2表达下降，诱导细胞凋亡【16J。一些类似的研究117J也发现，一些化疗药物如阿霉素或顺铂，可以通过转录后机制，诱导AP．20【的产生，增加对化疗药物的敏感性。总之，通过对胰腺癌的研究，我们推测，利用AP．2lx的过表达，可以减少肿瘤细胞的生长，同时，AP．2a还可以通过提高肿瘤细胞对传统化疗药物的敏感性，起到抑制肿瘤细胞生长的作用。2．3AP．2a在肺癌中的作用尼古丁本身不是致癌物，但能诱导肿瘤细胞增殖和分化【18J。在小细胞肺癌中，AP一20【表达降低，可促进尼古丁刺激PPARl3／],的产生，促进肿瘤细胞增殖119l。ShouWeiHan，eta1．120J发现，激活p38MAPK、诱导AP．20c蛋白的表达和增加AP．2aDNA的结合活性，均可抑制NSCLC细胞的增殖作用。同时，AP．2a又可以通过与人端粒米端转移酶催化亚基亚单位(hTERT)的启动子结合，而调节hTERT的表达，进而参与肺癌的演进过程121J。AP．2Q具有双重作用，即：可以促进细胞凋亡，又可以参与抑制细胞凋亡的作用。这是因为在不同组织中，AP．2lx启动了不同的下游基因的转录。上皮卵巢癌【22】、结肠腺癌123l、人神经胶质瘤1241、部分前列腺癌【25】和黑色素瘤【26】研究中，AP．20【是作为抗凋亡因子发挥作用的；而在人慢性扩张型心肌病和部分人乳腺癌的研究中，AP．2a表达的增加，可起到促凋亡的作用【271。肺心病的研究【28J中发现，5％浓度的香烟提取物(CSE)刺激ECV304细胞，增加细胞中AP．20【的表达，AP．20【的过表达，抑制5％CSE诱导的细胞凋亡以及抑制caspase．3的表达，AP．2仅保护ECV304细胞免遭CSE诱导的细胞凋亡，从而，AP．2仅在COPD的细胞凋亡过程中，起着重要的保护作用。2．4AP．2q在卵巢癌中的作用在SKOV3卵巢癌细胞系，AP．2Ix的表达抑制细胞增殖和侵袭，同时又可减62 综述一少pro．MMP一2和增加E-cadherin的表达。在上皮性卵巢癌细胞质中，AP一2a的表达减少，单独或同时存在细胞核高表达AP．20c，可预测预后不良1291。然而，在卵巢癌晚期，AP一2丫细胞核表达上调，却没有预测价值。2．5AP．2a在乳腺癌中的作用AP．2a和AP．针参与调控乳腺细胞的命运，如细胞增殖、凋亡及分化，它们不恰当的时空表达，可能导致乳腺细胞恶性转化。正常乳腺组织中，AP．2a和AP．2Y表达不发生重叠；而在未分化的乳腺癌组织中，可检测到AP．20【和AP．针共表达的现象【30j。一些研究还发现，乳腺组织中AP一2q起着肿瘤抑制的作用。与良性乳腺组织和原位乳腺癌组织相比，侵袭性的乳腺癌组织中AP．2ct细胞核表达显著减少，并且伴随着AP．2a下游基因的表达也发生相应地变化，如：EGR，1，ER，p21WAF／CIP，致癌基因ERBB2等(在它们的启动子或增强子区域均含有AP．2a的结合位点)。在侵润性乳腺癌组织中AP．2a表达下调，与HER一2表达呈负相关，而与ER和p21的表达呈『F相关，AP．2仅细胞核表达减少，与乳腺癌细胞不良分级也相关【3l】。PellikainenJ等人【32】采用免疫组织化学实验方法检测420例乳腺癌样本中AP．20【的表达，结果发现：与『F常乳管上皮细胞比较，在癌变的乳管上皮细胞中，AP．2Gt在细胞核内的表达明显降低。而占所有乳腺癌样本中的47％的病例中，则出现了AP．2et在细胞质的表达，从而推测，AP．2ct在细胞核内的低表达和／或迁移至细胞质中的表达，预示着患者乳腺癌发病间歇期变短，存活率和治愈率均降低。VerenaThewes，eta1．|33j用显性失活的AP．2突变体，即：阻断AP一2家族各成员基因的表达，干扰AP．2蛋白的合成，转染N202．1A乳腺癌细胞后，促进乳腺癌细胞发生凋亡，以及增加对化疗药物的敏感性。从而说明，在乳腺癌的发病中，AP．2家族的某些成员可能促进肿瘤细胞的发生及发展。从以上这些资料分析得出，在乳腺癌组织中，由于AP．2a细胞核表达减少，通过调控下游基因的表达，表现出促进肿瘤生长的作用。3AP．2a与糖尿病的研究胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病因，脂肪组织分泌的一些脂肪因子与胰岛素抵抗有着密切的联系。有研究表明【34】，AP．2a表达下调，是启动脂肪细胞分化的重要转录因子。AP．2(t可与脂肪细胞分化的转录激活因子C／EBPⅨ基因结 综述一合，调控其转录活性，C／EBPa基因表达增加，可促进脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化。另外，AP．20r通过转录性调节胰岛素受体的表达，在糖尿病疾病中起着一定的作用。周求知135J等在小鼠前脂肪细胞3T3一L1中，分离AP．20【相互作用蛋白，利用MALDI．TOF—MS技术，鉴定了3个AP．2a结合蛋白。这3个AP．2a结合蛋白参与电子传递、脂代谢和脂肪酸代谢等过程。因此，AP．2ct可协同调控脂肪细胞分化成熟及脂肪因子的分泌。ATP．bindingcassetteA1(ABCAl)的表达，是高密度脂蛋白形成的主要蛋白，高密度脂蛋白的减少与2型糖尿病有关。PKDIAP．2a信号通路负性调节ABCAl的表达，抑制PKD，促进高密度脂蛋白以及脂联素的表达，从而，减少由肥胖和糖尿病等引发的心脏血管性疾病【36J。所以，AP．2a表达异常时，可能与糖尿病、肥胖等代谢性疾病的发生有关。4AP．2Q与胚胎发育及胎盘滋养细胞分化的研究AP．2Q参与神经嵴及其衍生的细胞、组织如：颅面器官、四肢和内脏的发育137J。在小鼠胚胎发育第8天，神经嵴细胞出现AP．20【的表达，于11．5天，AP一20【的mRNA表达达到高峰，其后表达平稳减少。AP．2Ⅱ表达于外胚层的上皮细胞，分布于脊髓、后脑直至感觉神经中枢。另外，四肢的芽状顶端的问叶细胞和胚胎外滋养细胞层细胞也有AP．2Q的表达【381。小鼠的分子遗传学研究表明，在哺乳动物发育过程中，对AP一2基因存在时空上的严格调控。AP．2ct(一／一)小鼠具有许多先天性畸形的现象，比如：一出生就死亡、或者出现胸腹腔不闭合、颅面器官及神经严重缺陷，头及四肢出现骨骼畸形或缺失等现象13⋯。AP一2a缺失的小鼠胚胎，还可出现小鼠眼睛的表型从完全没有眼睛到晶状体不同程度的发育不全。正常情况时，AP．2a选择性表达在晶状体外胚层细胞上，而在晶状体的赤道圈终止，14天的小鼠纤维细胞表达AP．2a，可引起双边性的白内障和小眼畸形【圳。AP．20【．／．与AP．20【+“嵌合体小鼠的眼表层有E—cadherin的表达，而E．cadherin的低表达与AP．2a-／．nullcells的位置一致【41】。所以AP．20【通过诱导cadherin的表达来调节眼睛表层的分化，AP．20r对E—cadherin基因的转录和眼睛的表层分化，起到正调控作用。滋养细胞分化过程中，转录因子AP．2a诱导细胞滋养细胞，融合形成合体滋养细胞，并且能促进滋养细胞合成及分泌胎盘特有激素，所以，AP．2a的出现，可作为细胞滋养细胞分化的生物化学特征。最早研究发现，滋养细胞分化的过 综述一程中，Ar．2仅能够激活HPLl421、hCG．仅和．6l43J的启动子，当AP．2a在这些基因启动子结合位点发生突变时，可阻止HPL和hCG基因的表达。通过与CREB蛋白问的相互作用，AP．2a又可以调控促皮质素释放激素启动子的转录活性I洲。滋养细胞中AP．2a也促进芳香化酶细胞色素P-450145|、生殖细胞碱性磷酸酶(germcellalkalinephosphatase)[46J和1713羟基固醇脱氢酶I基因【47J的表达。AP．2u在羊胎盘、牛胎盘分化的研刭48J也表明，AP．20【可诱导调节胎盘泌乳素基因和一些其他基因的表达。为了检测人滋养细胞分化过程中，AP．2a是否是遗传程序中的一个关键因素，利用DNA微阵列分析【49j显性失活AP．20【蛋白对体外细胞滋养细胞分化的效应，人们发现AP．20．不影响融合细胞滋养细胞形成，但在滋养细胞分化过程中，显性失活的AP．2a显著抑制诱导或抑制一些由AP．2a调节基因的表达，这些基因大多数与细胞外结构、细胞内的信号通讯及信号转导有关。这些发现强有力的说明，AP．20r在诱导和抑制这些基因方面，起着关键性的作用，而这些基因参与滋养细胞分化和成熟。当用AP．2et质粒转染细胞滋养细胞，AP．2a的过表达能恢复由显性失活AP．20r对合体滋养细胞特殊基因hPL、hCG、CRH和PSGl的mRNA水平的抑制效应【50J。这个实验表明，这些在基因上存在AP．20r结合位点，它们是通过与AP．2a结合位点结合而起作用的。人胎盘仅仅表达AP．2家族中的AP．2a和AP．2Y亚型。众多调查研究显示，AP．2Q在一些类型细胞的分化中，起着重要的作用，包括角蛋白和神经嵴细胞的分化和3T3．L1成纤维细胞分化成脂细胞f51J。大部分研究表明，AP．20【和AP一柳结合相同的DNA元件(GCCNNNGGC)。然而，这两个亚型在生物作用上有着显著的差异。例如，AP一20c基因敲除鼠在出生时就死亡，而AP．2丫敲除鼠在怀孕7．5天，即胎盘完整形成前就发生死亡。这个发现说明这两个亚型激活不同的靶点，可能是由于这两个转录因子结合不同的配体，即共激活剂和／或共抑制剂的原因。当前，关于调节胎盘AP．2仪基因表达的因素不清楚。目前已经发现【52lcAMP、前列腺素、维甲酸、甲状腺激素、炎症细胞因子和雌激素可诱导AP．2a转录活性。另外，在一些类型的细胞中，转录因子Spl、Rb蛋白、糖皮质激素受体(GR)、p．连环蛋白和其它蛋白与AP．2c【形成复合物，可协调或抑制AP．2a的活性【53】。然而，这些因素对AP．2Y的活性的影响不清楚。最近研究【54】，利用福司柯林可诱导JEG．3人绒毛膜癌细胞中AP．2a的基因表达，但不能诱导AP．柳的基因表达，说明AP．2家族的这两个亚型在正常滋养细胞中，受到不同因素的调节。细胞滋养细胞分化过程中，AP．2amRNA显著增强，同时伴有HPL、hCG—a和一B65 综述一mRNA的增加，而AP．23'mRNA表达显著降低，说明在细胞滋养细胞中AP．2Y是主要亚型，在细胞滋养细胞分化过程和完全分化的合体滋养细胞中，AP一20【则是主要亚型。AP．20【通过Bax／cytochromeC／Apafl／caspase／9依赖的线粒体途径，下调Bcl．2的表达，从而诱导细胞凋亡155l。Hilger-Eversheiml56J观察到AP．2a通过诱导细胞周期停滞和诱导细胞凋亡，而抑制细胞生长。AP一2Gt过表达能抑制细胞分离和集落形成，然而，用显性失活AP．2Gt突变体下调AP．20r，可增加细胞的侵袭和致瘤性。AP．2Gt上调p21mRNA和蛋白的表达，诱导G1和G2细胞周期停滞，抑制细胞增殖1571。AP．20【也调节与维持细胞结构完整有关的基因的表达，例如：E．cadherin、MMPs和连接蛋白。在乳腺癌、结肠癌和恶性黑色素瘤中，AP．20【是作为肿瘤抑制剂而起作用的。在人绒毛膜癌细胞，AP．2Gt的表达减少，能促进细胞恶性转化，并能阻止细胞滋养细胞正常分化成合体滋养细胞。用核激素受体NR2F2(ARP．1)表达质粒和含有荧光表达载体的AP．20r表达质粒，共转染不表达AP．2q的HepG2细胞，发现共转染可增强AP一2a的转录活性；NR2F2siRNA显著阻断NR2F2、AP一20t、hPL、CRH和妊娠特殊糖蛋白(PSGl)的mRNA的表达，同时，NR2F2又能促使维甲酸类受体诱导转录激活AP．20r[58J。从这些结果表明，NR2F2调节滋养细胞分化，可能是通过激活AP一2ct基因的表达，以及通过增强RARa和RXRa对AP一2Gt的作用而实现的。维甲酸诱导滋养细胞分化，可能一部分是通过激活AP．2ct的转录活性而实现的。SchleissMR[59J等观察到用表达低水平AP一2Gt的巨细胞病毒感染人胎盘，发现巨细胞病毒感染的滋养细胞比没有感染的滋养细胞中AP．20r表达大约减少80％，同时，依赖于AP．2Gt调节基因的表达也减少50．80％。充分说明，胎盘分泌的一些特殊基因是依赖于AP．2Gt转录性调节的。5AP．2a在子痫前期发病机制中的作用根据TomomiKotani[60l等研究发现，在子痫前期胎盘合体滋养细胞和绒毛膜外滋养细胞上，AP．2仅和AP．却的表达显著高于正常晚孕组。由于合体滋养细胞AP．20【和AP．柳表达异常增高，可增加依赖于AP．20c转录调节的p-hCG亚型的分泌。为了进一步探讨AP．2a在滋养细胞功能上的作用，我们采用AP一2仅真核表达载体，转染绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞，发现在BeWo细胞中，AP．2a过表达，可引起E．cadherinmRNA和蛋白的表达均显著增加；而MMP．9mRNA 综述一和蛋白的表达则显著降低，同时，采用transwell方法检测BeWo细胞侵袭行为，我们发现当AP．2a过表达时，BeWo细胞侵袭细胞数量明显减少，这一结果进一步说明，AP．2Gt可能通过转录性上调E．cadherin和反式调控MMP．9的表达，对滋养细胞的侵袭行为起着负调控的作用。另外我们还发现，重度子痫前期胎盘组织中，AP．20【和Bax、Bcl．2的表达异常。为了进一步研究AP．2Gt与Bax、Bcl．2的关系，我们采用AP一2a载体及人工合成AP一2asiRNA，分别瞬时转染BeWo细胞，采用流式细胞技术，观察BeWo细胞凋亡的变化，我们发现，AP．2Gt促进BeWo细胞凋亡，也增加Bax的表达，同时抑制Bcl一2的表达。AP．2a可通过直接结合Bcl．2启动子．48到．39氨基酸位点，即：5'-CTCTCCCCGC．3’，而转录性抑制Bcl一2基因的表达；同时AP．2a又可以改变Bax的转录，使BaxN端和疏水区C端发生构象改变，使其移位至线粒体外膜，因此，我们推测：AP．2a既能通过转录性调节E．cadherin和MMP一9的表达，影响滋养细胞外基质的功能，从而，抑制滋养细胞的侵袭行为，同时，AP．2a又利用Bcl一2／Bax依赖的线粒体凋亡途径，通过促进滋养细胞凋亡，减弱滋养细胞的侵袭数量，而最终导致胎盘“浅着床”和血管重塑障碍，引发子痫前期的各种临床症状。67 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综述二胎盘细胞凋亡与病理妊娠的研究进展张玲张展综述审校引言子痫前期和胎儿宫内生长受限(IUGR)是妊娠期的重要合并症，是导致孕产妇、围生儿死亡率和发病率的主要原因。到目前为止，它们的发病机制还不是很清楚，但大多数学者们认为，胎盘功能障碍可能是它们发病的中心环节。近年来研究表明，胎盘发育有赖于滋养细胞分化与凋亡的平衡，当滋养细胞凋亡异常时，与子痫前期、胎儿宫内生长受限、葡萄胎(滋养细胞增生)等疾病发生、发展关系密切，因此，认为细胞凋亡是胎盘功能障碍的重要机制之一。现将近几年来关于滋养细胞凋亡与正常胎盘发育和胎盘源性疾病(如：子痫前期等)发病机制方面的研究综述如下。1凋亡最早由Kerr和Wylie在1972[1J年提出，细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下，发生的一种程序性死亡，是以细胞质浓缩、细胞器被细胞膜包裹形成凋亡小体为特征。在细胞核浓缩的过程中，核纤层消失，DNA被降解成200对碱基大小的片段【2，3J。另外，由于细胞被分成许多膜泡，这些膜泡从细胞表面脱落后形成凋亡小体，磷脂酰丝氨酸外化，从而引起巨噬细胞等发生吞噬现象14J。与细胞坏死死亡相比，凋亡过程是一系列能量依赖性事件，在避免引起免疫反应、损坏周围组织的情况下，移除不需要的细胞内的物质。凋亡可通过外源性和内源性的通路启动。两条通路均依赖于14个半胱氨酸蛋白酶caspases家族蛋白之间的相互反应。Caspases可以产生结构蛋白，并诱导产生凋亡的典型形态学改变，通过一系列caspases级联反应，而介导细胞凋亡。另外，激活的caspases通过激73 综述二活一系列促凋亡蛋白，而起到增强凋亡信号的作用。细胞凋亡的外源性通路由肿瘤坏死因子和凋亡受体家族成员调节。这一家族有8个成员，其中Fas、TNF—R1、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)被广泛研究【51。外部的配体与凋亡受体结合，引起受体与胞浆死亡结构域之I’白J蛋白与蛋白的相互反应，比如Fas相关死亡域(FADD)和TNF．R相关的死亡域16J。FADD与死亡受体结合，通过死亡效应域募集procaspase一8或procaspase．10。这些蛋白的结合形成死亡诱导信号复合体，其可分解procaspase一8和procaspase一10，使其形成活性形式，引起凋亡级联反应【7】。有时，caspase．8分解Bid可使此凋亡信号进一步放大，它也可以激活凋亡的内源性通路拶j。细胞凋亡的内源性通路由细胞应激启动，比如：DNA的损伤、活性氧、未折叠蛋白反应，缺少生长因子支持等，由于促凋亡和抗凋亡Bcl．2蛋白的失平衡，内源性通路的激活引起线粒体膜通透性改变【引。线粒体膜通透性的增加导致膜小孔的形成和细胞色素C向胞浆的渗漏。在胞浆中，凋亡蛋白酶活化因子．1(APAF．1)与细胞色素C结，合形成凋亡复合体。凋亡复合体裂解procaspase．9，从而，激活凋亡最终通路【10J。在凋亡中，其他线粒体内容物，比如smac／Diablo也从线粒体中释放出来，拮抗凋亡蛋白的抗凋亡抑制剂【11J。以上这两条通路均在最后达到高峰，包括caspase．3，、6、7的裂解和激活，其又通过激活DNAses、裂解DNA修复酶，如PARP，启动破坏细胞的过程112J。凋亡细胞可被多种方法证实。最初细胞形态学的描述，基于电镜观察其超微结构，包括核／浆比例增加，细胞质固缩，细胞核周围常染色质沉积，随后，发生细胞形态的改变113J。生物化学检测方法通过DNAladders的存在，已经证实DNA裂解成200bp的片段ll引。再之后，组织学和生物化学方法相结合，促进了染色技术的发展，其可通过脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法的(TUNEL)115】方法，利用磷脂酰丝氨酸的外化或者caspase活性的细胞骨架蛋白裂解产物，比如细胞角蛋白M30抗体结合位点，来鉴别裂解的DNA片段1161。通常，学者会结合多种检测方法证实细胞凋亡。2细胞凋亡与胎盘种植胎盘的正常发育，首先依赖于滋养细胞向母体蜕膜层等有效的侵袭，随后对母体螺旋动脉发生重构，使胎盘得以正常稳定的种植于子宫内，并形成有效74 综述二的子宫胎盘血流11。7I。在早期妊娠，细胞滋养细胞形成细胞滋养层柱，通过与子宫壁接触并侵袭母体蜕膜层、子宫螺旋动脉及将近至子宫肌层的外1／3层，其中在胎盘附着部位的中央位置，滋养细胞会侵袭的更深，同时伴随着血管内皮细胞发生凋亡，滋养细胞表现出内皮细胞的部分特征，最终替代内皮细胞成为血管壁的一部分，从而使子宫螺旋动脉管壁变薄，管腔扩张，形成低抵抗、高血流量的血倒18J。当滋养细胞侵入缺失或者侵入深度不够，就会引起螺旋动脉重塑发生障碍。尽管，此过程最终需要滋养细胞得以实现，但是最初也具有滋养细胞依赖性119J。最近研究【20J表明，血管重铸可能问接地受血管内滋养细胞的调控，血管内滋养细胞可以刺激内皮细胞分泌趋化因子等。这些趋化因子可以吸引并激活蜕膜组织中的白细胞，尤其是子宫自然杀伤细胞和巨噬细胞，导致血管平滑肌细胞发生凋亡。内皮细胞受损可能机制之一是通过Fas／FasL系统，此系统存在于子宫螺旋动脉的内皮和血管平滑肌细胞121j。在整个蜕膜组织中，母体螺旋动脉的重塑不是均匀分布的，与蜕膜组织边缘部位相比，接近蜕膜组织的中央位置，则有更多的螺旋动脉发生重塑12引。除了滋养细胞参与母体螺旋动脉重铸过程外，研究还表吲23J，在接近10周以内的妊娠，滋养细胞还可以通过阻断母体血流量，从而使胎儿在最初缺氧的环境下发育，并保护胎儿免受活性氧等的损害。滋养细胞发生过度凋亡，一方面、引起侵入母体螺旋动脉的滋养细胞数量减少，螺旋动脉不能有效地扩张；另一方面、又能减弱滋养细胞的侵袭能力。滋养细胞侵袭减少及母体螺旋动脉不能『F常改建，形成低阻高容的血管，导致胎盘缺氧、供血不足，而诱发子痫前期的发生。在更多的子痫前期和IUGR等疾病的研究中，确实发现存在螺旋动脉中滋养细胞数量减少的现象，这可能与细胞凋亡增加、血管变小有关124J。也有学者发现陋J，重度子痫前期滋养细胞侵袭范围下降，包括螺旋动脉和子宫肌层。滋养细胞侵袭过浅、子宫螺旋动脉重铸障碍，导致胎盘血流供应压力升高，反过来又影响绒毛树的发育，导致胎盘结构的异常改变【26,27J，从而形成恶性循环，加重病情的发展。在IUGR和子痫前期疾病中，异常的多普勒超声波形也表明，这种损害可以导致缺氧，并影响血流的供应12剐。75 综述二3胎盘绒毛凋亡妊娠10周后，在母体血流存在的情况下，人类胎盘绒毛发育，分俞生枝形成绒毛树状结构，继续分支、盘绕，相互交错最终形成复杂的终端绒毛。这些终端绒毛由基质组成，容纳胎儿毛细血管。在细胞滋养细胞层的外层，由连续的多核合胞体，即合体滋养细胞覆盖。合体滋养细胞是构成胎盘的主要成分，并成为胎儿和母体之间的保护性屏障，不仅仅阻止胎儿抗原与母体淋巴细胞及母体抗滋养层抗体的接触，避免发生免疫排斥反应，同时还能提供『F常的气体交换、营养物质供应和排除废物等作用。细胞滋养细胞有丝分裂，并伴随着滋养细胞膜的消失，从而融合成合体滋养细胞，这被认为是合体滋养细胞补充的方式之一；另外，研究也发现，绒毛细胞滋养细胞融合成合体滋养细胞与GCM．1、合胞体蛋白．1，。2和caspase．8的存在相关【291。但是，细胞滋养细胞和合体滋养细胞的确切的生理功能还不是很清楚。在整个『F常妊娠过程中，胎盘绒毛细胞凋亡的数量不是固定不变的，在妊娠早期，绒毛滋养细胞凋亡数量最少，而在妊娠术期，细胞凋亡的数量逐渐增加，到妊娠40周后，滋养细胞凋亡数量则显著增加【30】。更多的研究【31,32,33l已经证实，病理胎盘，包括流产、子痫自仃期、IUGR、妊娠滋养细胞疾病(例如：部分和完全性葡萄胎、绒癌)等，均存在绒毛滋养细胞凋亡显著增加的现象。这一发现激起了学者们极大的兴趣，并深入研究检测到全身系统性疾病也能影响胎盘功能，例如，孕妇合并妊娠期糖尿病与胎盘滋养细胞过度凋亡密切相关134|。另外，研究也发现【35|，细胞凋亡现象并不仅仅局限于胎盘组织，在子痫前期中，母体血清中可检测到细胞角蛋白M30来源的合胞体水平增加。绒毛的凋亡主要定位于合体滋养细胞，足月妊娠细胞滋养细胞几乎不存在凋亡，妊娠早期细胞滋养细胞凋亡水平也很低【36J。合体滋养细胞表现的特点与凋亡一致，比如：磷脂酰丝氨酸外化、caspase．8和caspase．9活性，细胞角蛋白．18裂解片段以及具有DNAse活性等【了刀。最重要的是，合体滋养细胞的维持，涉及到细胞凋亡的机制。此理论基于两种现象，一：细胞滋养细胞融合成合体滋养细胞涉及到caspase．8的参与，二：一些合体滋养细胞胞核呈现出凋亡的形态学特点，比如：细胞核周边染色质凝聚，逐渐形成核固缩。在合体滋养细胞内，固缩核聚集形成合体结，在固缩核以膜结合实体释放入母体循环之前，其在合胞体表面聚集。合体节是绒毛滋养细胞的一种老化和退化现象，同时也可作为细胞凋亡的一种特征。已经证实【38】，这些物质首先存76 综述二在于母体静脉循环中，然后被肺脏巨噬细胞破坏。凋亡物质释放入母体循环，被认为是子痫前期母体内皮受损的机制之一【3引。然而，凋亡细胞核组成合体结的理论受到了质疑。国外有学者通过电镜观察发现，在妊娠晚期，胎盘绒毛滋养细胞的表面是不连续的，尤其是与损伤(例如：纤维素沉积)相关的区域，在这些不连续断点的下方，有纤维蛋白沉积于滋养细胞的基底面，并起到支架作用，也正是因为存在这种不连续的结构，从而才保证母儿问物质交换的有利进行，而细胞凋亡恰恰是维持这种组织结构的关键因素【4Ⅲ。在整个合体滋养层中存在凋亡信号的传递，当滋养细胞适度发生凋亡时，对妊娠过程起着积极地作用；但是，一旦细胞凋亡紊乱，就有引发病理妊娠的潜在可能性。妊娠合并症疾病中存在细胞过度凋亡的起因，还不是很清楚。尽管，滋养细胞中细胞凋亡的外源性通路被激活，但是，在体内，子宫螺旋动脉的异常重塑更容易合并缺氧和／或氧化应激。在体外，使滋养细胞暴露于缺氧和活性氧的环境中，同样地发现存在细胞凋亡过度的现象【4¨。有意思的是，妊娠合并IUGR或子痫前期的胎盘绒毛滋养细胞凋亡易感性增加，某些内在的改变使这些细胞更容易受到氧化应激的损伤1421。在葡萄胎病理妊娠中，细胞凋亡增加，被认为可以用来反应一些过度增生滋养细胞的命运。在更具侵袭性和增生性的疾病中，也存在细胞过度凋亡的现象，这也证实了这一点【431。促凋亡和抗凋亡调节因子的相互作用对调控凋亡十分重要。促凋亡和抗凋亡调节因子在绒毛滋养细胞中表达，是目前研究的一个重要方向。目前已经比较明确的了解ⅢJ，细胞滋养细胞和合体滋养细胞均表达，Bcl．2家族、TNF受体、Fas和Fas配体、TRAIL、TRAIL的死亡和诱导受体。这些因子可能不仅在凋亡中发挥重要作用，也在免疫调节中发挥作用。参与调控细胞命运的其他重要调节因子还包括转录因子AP一2a、p53等。P53表达于细胞滋养细胞，合体滋养细胞极少。在正常胎盘或者妊娠滋养细胞疾病的胎盘中，p53是未突变、野生型【45。。相反，p53的天然抑制剂Mdm2在妊娠早期的细胞滋养细胞和合体滋养细胞均有表达，而到了妊娠晚期其表达水平明显下降146|。P53的许多耙蛋白在胎盘绒毛均有表达，包括细胞周期调节蛋白P21。P21在妊娠早期细胞滋养细胞表达水平很高，合体滋养细胞和妊娠晚期滋养细胞则表达稍低H71。77 综述二4细胞凋亡参与胎盘疾病的发生通常，在IUGR和早发型子痫前期疾病中(国外大多采用孕32周前发病作为早发型子痫前期，而国内则主要采用以孕34周前发病称为早发型子痫前期)，其胎盘绒毛组织出现更多显著的形态学和异常发育的现象。这些变化主要表现为，绒毛发育不足以及毛细血管增殖减少。在子痫前期中148l，细胞凋亡与合体滋养细胞的减少相关，不正常的合体滋养细胞形成或合胞体的过度减少证实了这一点。在子痫前期和IUGR中，发现多种促凋亡和抗凋亡蛋白表达水平发生改变。例如，在子痫前期中，P53[491和促凋亡亚型Mcl一1、Bax[50】的表达增高，Bcl一2【51】和合胞体【50J蛋白水平则下降。也有研究发现，合并HELLP综合症的重度子痫前期患者p53水平升高【52】。IUGR患者与p53、caspase．3、p21水平升高相关【53】。5细胞凋亡和母体血管子痫前期和IUGR不仅与细胞凋亡有关，而且与过多的合胞体结形成相关。在子痫前期中，与几乎所有的终端绒毛相比，10．30％的正常终端绒毛中含有合体结【5训。从妊娠中期开始，母体循环系统中存在合体滋养层微绒毛膜的小微粒(STBMs)，并且随着妊娠的进展，微绒毛膜的小微粒逐渐增加，被认为是正常合体滋养细胞流转的部分，可代表凋亡物质，此物质的增多与子痫前期相关，而与IUGR无关155|，这与合体滋养细胞丢失和损坏过多相一致【56J。此发现在体外低氧条件下也被证实，从而说明，缺氧和氧化应激是合体结形成的潜在病理生理学的触发物157,58J。其他小片段，包括胎儿游离DNA，也被释放并可能与重度子痫前期的发生有关159‘。6合胞体碎片和系统性炎症反应母体循环系统中，STBMs和新发现的纳米粒子的存在与免疫反应改变相关，尤其是中性粒细胞活性和超氧阴离子自由基的释放【60,61】。来自这些妊娠的胎盘中，中性粒细胞活性增加与DNAlattices(NETS)的增加相关【61】。用非妊娠妇女的外周血单核细胞来源的微粒培养滋养细胞，可刺激细胞因子的释放，TNF—alpha，IL-lbeta，IL-6，IL-8，ILl2p70，IL-18，细胞粘附分子CD54也增加【62，631。这些发现说明，系统性炎症反应在子痫前期中是增强的。来自母体单核细胞的IL-1]3，IL-6，和7R 综述二IL-8的水平升高，也证实了这一点【删。另外，子痫前期还存在的特点是，STBMs可损伤内皮细胞，促进胎盘滋养细胞凋亡、合胞体微小粒子释放及母体血管并发症等【65】。7总结凋亡是妊娠过程中滋养细胞绒毛发育过程存在的一种现象，是胎盘侵袭、细胞滋养细胞融合、合体滋养细胞功能的一个重要特点，也在母体免疫耐受过程中，发挥着潜在的作用。许多主要的蛋白和因子以外来身份出现在胎盘中，并调控胎盘组织对外在刺激的反应，目前，这些蛋白和因子中只有～部分被发现。当前，我们知道，缺氧，活性氧等外来因素引起的胎盘功能改变，可以引起胎盘凋亡显著增加。这可能是子痫前期和IUGR病理生理改变的潜在原因。越来越多的资料证明，胎盘的异常凋亡影响胎盘、母体血管内皮细胞的功能、影响免疫耐受。今后，随着对参与调解凋亡的主要蛋白通路的了解不断加深，我们可能会研究出对子痫前期有进一步的治疗方案。79 综述二参考文献【1】【212【3】【4】【5】5【6】【7】【8】【9】【10】KerrJF,WyllieAH，CurrieAR．Apoptosis：abasicbiologicalphenomenonwithwide—rangingimplicationsintissuekinetics[J]．BrJCancer1972；26：239-257．LazebnikYA，ColeS，CookeCA，eta1．Nucleareventsofapoptosisinvitroincell—freemitoticextracts：amodelsystemforanalysisoftheactivephaseofapoptosis[J]．JCellBiol，1993；123：7—22．ArendsMJ，WyllieAH．Apoptosis：mechanismsandrolesinpathology[J]．IntRevExpPathol，1991；32：223—254．Calpe—BerdielL，ZhaoYDeGraauwM，eta1．MacrophageABCA2deletionmodulatesintracellularcholesteroldeposition，affectsmacrophageapoptosis，anddecreasesearlyatherosclerosisinLDLreceptorknockoutmice[J]．Atherosclerosis，2012；223(2)：332—341．KrieglL，JungA，HorstD，eta1．Microsatelliteinstability,KRASmutationsandcellulardistributionofTRAIL—receptorsinearlystagecolorectalcancer[J]．PLoSOne，2012；7(12)：e51654．RanjanK，SuroliaA，PathakC．ApoptoticpotentialofFas—associateddeathdomainonregulationofcelldeathregulatoryproteincFLIPanddeathreceptormediatedapoptosisinHEK293Tcells[J]．JCellCommunSignal，2012；6(3)：155—168．QiuJ，WhalenMJ，LowensteinP，eta1．UpregulationoftheFasreceptordeath-inducingsignalingcomplexaftertraumaticbraininjuryinmiceandhumans[J]．JNeurosci，2002；22(9)：3504—3511．HegdeM，KarkiSS，ThomasE，eta1．Novellevamisolederivativeinducesextrinsicpathwayofapoptosisincancercellsandinhibitstumorprogressioninmice[J]．PLoSOne，2012；7(9)：e43632．NeohCA，WangRY,DinZH，eta1．InductionofapoptosisbysinulariolidefromsoftcoralthroughMitochondrial—relatedandp38MAPKpathwaysonhumanbladdercarcinomacells[J]．MarDrugs，2012；10(12)：2893—2911．KimJ，ParrishAB，KurokawaM，eta1．Rsk．mediatedphosphorylationand14—3—3￡bindingofApaf-1suppressescytochromeC·inducedapoptosis[J]．EMBOJ，2012；31(5)：】279．1292．【11】KohDW,DawsonTM，DawsonVL．Mediationofcelldeathbypoly(ADP．ribose)polymerase-1【J】．PharacolRes，2005；52：5-14．【12】TewariM，OuanLT,O’Rourkel(，eta1．Yama／CPP32[beta]，amammalianhomologofCED-3．iSaCrmA-inhibitableproteasethatcleavesthedeathsubstratepoly(ADP—ribose)polymerase[J]．Cell，1995；81：801-809．【13]PamenterME，PerkinsGA，McGinnessAKeta1．Autophagyandapoptosisaredifferentiallyinvitromimicoftheischemicpenumbra[J]．PLoSOne，2012；(12)：e51469．【14】LevyR，SmithSD，ChandlerI<，eta1．Apoptosisinhumanculturedtrophoblastsis 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个人简介及攻读}尊十学位期间发表的文章个人简历个人简介及攻读博士学位期间发表的文章张玲，女，1977年9月生，河南省开封市通许县人。中共党员，妇产科主治医师。2002年取得执业医师证书，2009年获得妇产科主治医师资格证书，2006年在郑州大学第三附属医院攻读硕士学位，2009年顺利通过郑州大学博士录取考试，在郑州大学第三附属医院攻读博士学位至今，并继续研究及从事妇产科临床医疗科研工作。攻读博士学位期问，发表SCI收录论文二篇。于2011年申报河南省教育厅科学技术研究重点项目一项：AP．2a在子痛前期发病中的作用。项目下达编号为：128320029。参加2012年郑州大学博士论坛获得三等奖；并获得2012年国家级优秀学生奖。攻读博士学位期间发表的文章1LingZhang，LitingJia，ShihongCui，YingShi，AiminChang，PengWang，ZhanZhang．(2012)AP一2a-dependentregulationofBcl-2／Baxexpressionaffectsapoptosisinthetrophoblast．JMolHist01．43(6)：681—689．(IF=1．484)第一作者2ZhanZhang，LingZhang，LitingJia，ShihongCui，YingShi，AiminChang，PengWang．(2013)AP一2aSuppressesInvasioninBeWoCellsbyRepressionofMatrixMetalloproteinase-2and-9andUp—regulationofE-cadherin．MolCellBiochemistry．DOI：10．1007／sllOlO一013·1685—8．(IF=2．057)第二作者85 致掳}致谢四年的博士生生活即将结束，回首过去的岁月，感慨良多，除心存感激之余，夫复何求?在论文即将完成之际，对曾经帮助我完成艰辛学业的所有老师、同学、家人和朋友表示最衷心的感谢!首先，我谨以最诚挚的敬意感谢我的导师张展教授，七年来无论是科研选题、实验设计、还是具体的整个实验过程，乃至SCI文章的撰写和发表，以及博士论文的撰写及修改都凝结了导师的心血和智慧的结晶。张老师是以大家的气度、创新的思维、渊博的知识和高尚的人格，给我留下了永生难忘的印象，为我树立了一辈子学习的典范，张老师的教诲与鞭策将永远激励我在医学的道路上，励精图治、时刻开拓创新。衷心感谢贾莉婷教授七年来对我的鼓励和无私关怀，您严谨的治学之道、宽厚仁慈的胸怀、积极乐观的生活态度，使我即使受到挫折时，仍能充满希望的前行。衷心感谢郑州大学第三附属医院检验科张琳琳老师、王鹏老师、石瑛老师及病理科王玉萍老师、曾宪旭老师、郝志伟老师等所有老师在实验技术指导等方面的精心指导和大力帮助。衷心感谢郑州大学第三附属医院妇产科的各位老师在实验实施和操作中的大力协助。衷心感谢郑州大学基础医学院赵国强教授在课题设计和实验技术等方面的精心指导和大力帮助。衷心感谢郑州大学第一附属医院重点实验室文建国教授、路彦涛老师、盛誉乔老师等给予实验场所及实验技术指导。衷心感谢医教科程国梅主任、丁丽玲老师在学习期间给予的大力支持和帮组。衷心感谢我的师姐妹大家庭中的每一个成员及同学常爱民、孙慧清、葛新、孙新城、夏天等多年来的并肩前行。衷心感谢在百忙中抽出时间审阅本论文的专家教授。衷心感谢我的好友张海燕和张强，在SCI论文撰写过程中的宝贵建议和及时点拨，使我的科研思路大开，并在我最艰难的时候给予我最无私的帮助，让我笑对困难，坚强地走下去。最后特别感谢我的家人，感谢家人多年来为我作出的牺牲以及对我工作学习的理解与支持和无私奉献，你们是我最坚强的后盾、避风港、前进的动力，为我排除了一切后顾之忧，让我完成艰辛的学业。曾对我帮助过而文中没有提及的朋友，不是因为你们的帮助微不足道，而是由于时间仓促，难免遗漏。再次向对我帮助过的各位老师、同学、亲人和朋友表示衷心地感谢!
