mir-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其机制研究

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1、中图分类号UDC博士学位论文学校代码密级miR．125a在破骨细胞分化过程中的作用及其机制研究ThefunctionalmechanismstudyofmiR-125a0n0Ste0ClaStdnlerentlatloAn■11●pp‘·‘作者姓名：雷丹丹学科专业：临床医学研究方向：内科学学院(系、所)：湘雅二医院指导教师：罗湘杭教授论文答辩日期丝!三：苎：拥答辩委员会主中南大学二。一三年五月l原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的

2、地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：夔盘壁日期：卫乒年上月盘日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数

3、据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：衄翩签名驰日期：码年三月鲨日miR．125a在破骨细胞分化过程中的作用及其机制研究中文摘要第一部分hsa．mir-125a在破骨细胞分化过程中的作用研究目的：研究hsa—mir-125a在破骨细胞分化过程中所发挥的作用方法：①体外培养CDl4+PBMCs，用RANKL联合M．CSF诱导其向破骨细胞分化，提取诱导前和诱导后不同时间点的细胞总RNA，采用RT-PCR法检测分化过程中hsa—mir-125a的表达模式。②在miRBase数据库中获得hsa-mir-125a的

4、前体序列pre—mir-125a，用pcDNA6．2一GW／EmGFP。miR载体合成hsa-mir-125a的表达载体pre．mir一125a，同时合成2’甲氧基修饰的hsa-mir-125a反义miRNA(anti—mir-125a)，并将pre—mir-125a、anti—mir-125a或其各自的阴性对照载体(miR-C)分别转染CDl4+PBMCs，转染后加入RANKL和M．CSF共同诱导细胞分化。③转染诱导后，用RT-PCR法检测细胞中hsa。mi卜125a表达水平的变化。④在转染诱导后第6天，提取细胞总R

5、NA，检测破骨细胞特异性标记TRAP、NFATcl的mRNA水平，同时收集细胞行TRAP染色实验观察破骨细胞分化情况。结果：①在诱导CDl4+PBMCs向破骨细胞分化过程中，随着诱导时间的延长，hsa—mir-125a的表达逐渐减少。②使用pcDNA6．2一GW／EmGFP—miR成功构建了hsa—mir-125a的表达载体pre—mir-125a，其转染的CDl4+PBMCs能在细胞中高表达Ilhsa-mir-l25a。@hsa—mir-125a高表达能降低破骨细胞分化特异性指标TRAP、NFATcl的mRNA水平，

6、减少TRAP阳性多核巨细胞的形成；而抑制hsa．mir-125a的表达后，TRAP、NFATcl的mRNA水平相应提高，TRAP染色阳性的多核巨细胞形成也较对照组明显增加。结论：hsa-mir-125a在破骨细胞分化过程中表达逐渐降低。过表达hsa．mir-125a可以抑制破骨细胞分化，而阻遏hsa-mir-125a的表达则促进破骨细胞分化。图7幅，参考文献32篇关键词：hsa—mir-125a；过表达；转染；TRAP染色第二部分hsa．mir-125a调控破骨细胞分化的机制研究目的：寻找hsa-mir-125a在破骨

7、细胞分化过程中作用的靶基因，探究hsa-mir-125a与其靶基因在调控破骨细胞分化过程中的相互作用机制。方法：①利用三种常用的靶基因预测软件预测hsa—mir-125a可能作用的靶基因，结合hsa．mir-125a在破骨细胞分化过程中的功能，在预测结果交集中筛选出TRAF6基因为潜在的靶基因。②根据hsa-mir-125a在TRAF6基因3'UTR结合位点的碱基序列构建野生型荧光素酶报告载体WT-pGL3一TRAF6—3’UTR和突变型荧光素酶报告载体MUT-pGL3．TRAF6—3’UTR。将这两个载体分别与pre

8、．mir-125a或对照载体(miR-C)交叉共转染CDl4+PBMCs后，检测载体的荧光素酶活性变化，验证TRAF6确为hsa．mir-125a作用的靶基因。③用pre．mir-125a单独转染CDl4+PBMCs，RT-PCR和WesternBlotting法分别检测TRAF6基因的mRNA和蛋白的表达水平变化。结果：①靶基因