酒精对胚胎发育的影响及文昌鱼、斑马鱼mef2、mrlc和hadh2基因的研究

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1、山东大学博士学位论文酒精对胚胎发育的影响及文昌鱼、斑马鱼Mef2、MRLC和hadh2基因的研究姓名：张颖申请学位级别：博士专业：发育生物学指导教师：张红卫20070330原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：鹜蓦致日期：呈盟：￡：5／关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使

2、用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：猛堑导师签名：《包＆!至日、吵山东大学博士学位论文酒精对胚胎发育的影响及文昌鱼、斑马鱼Alef2、MRLC和hadh2基因的研究中文摘要关于酒精对人类胎儿的发育毒性最初报道于1968年，孕妇饮酒会导致胎儿酒精综合症(E蜩)．FAS的主要特征是发育延迟、心脏异常、中枢神经系统异

3、常、颅面部特征异常及骨骼缺陷等。据估计，在一般人群中，新生儿的FAS发生率为l-2‰。中枢神经系统是酒精的作用靶标，酒精处理会导致神经管缺陷(neuraltubedcf乩乜，NIDs)，而》mD曩是最普遍的先天性缺陷之一，发生率为O．5．12％o，但对其发病机制尚不清楚。斑马鱼属硬骨鱼，是发育生物学的模式生物之一，已被证明为人类疾病和药物毒性评价的理想动物模型。本研究以斑马鱼为模式动物，研究酒精对斑马鱼早期胚胎发育的影响，试图揭示酒精对胚胎发育的影响机制，以期为人类先天性神经管缺陷的防治提供理论依据，为孕妇杜绝饮酒和优生优育提供科学指导。本研究首

4、先用不同浓度的酒精处理不同发育时期的斑马鱼胚胎，通过系统观察发现，酒精对斑马鱼胚胎发育的影响存在明显的时期和浓度依赖性，3％酒精于dome期开始处理胚胎3h对胚胎的体轴发育影响明显，极易引起轴裂(splitaxis)，即体轴后部出现分叉，但在近尾部区又合在一起。综合形态学、组织学观察及原位杂交结果发现，轴裂胚胎的体轴后部出现了2条脊索、神经管及2套体节，与人类的神经管缺陷脊柱裂的表型有相似性。通过分析推断，轴裂胚胎2条神经管和2套体节的形成可能是由裂开的脊索诱导的。实验还发现，酒精处理可明显地延迟胚胎的发育，从domo期开始处理3h后，酒精处理胚

5、胎仅处于50％下包期，而正常胚胎发育至接近70％T包，受精后大约11h酒精处理胚胎仍处于原肠胚期，而胚胎细胞的集中延伸运动是该时期的关键事件。为了进一步探寻酒精引起轴裂的致畸机制，利用原位杂交方法研究了酒精处理胚胎中几个发育相关重要基因的表达，结果发现，酒精处理对体轴发育相关基因月绣MyoD，neurogenml，tbx6和gse的表达图式具有明显的影响，特别于受精后大约llh，酒精处理胚胎与正常胚胎上述5个基因的表达图式差异显著，ntl的表达区域在酒精处理胚胎的背部分为两部分，MyoD的表达区域变宽，neurogenml在腹侧原7山东大学博士学

6、位论文神经细胞丛中的表达出现分叉，tbx6的表达区域明显变大，且在预定体节板中的表达图式不规则，gsc的表达区域分为两部分，这些结果提示，酒精干扰神经外胚层和中胚层细胞的集中延伸运动，特别是槲表达细胞不能集中到体轴中线处。而埘已证明与斑马鱼胚胎的集中延伸运动存在密切关系，是脊索区集中的一个关键调节子，与非经典的Wnt信号通路共同调节斑马鱼身体后部的形态发生。因此可以推断，酒精干扰胚胎细胞的集中延伸运动引起轴裂。文昌鱼是一种头索动物，被认为是现存的最接近于脊椎动物的无脊椎动物，具有许多脊椎动物发育相关基因的同源基因，是研究动物发育机制及脊椎动物起源

7、与进化的典型材料。斑马鱼是研究脊椎动物发育机制的理想动物模型。随着分子水平研究的不断深入，对文昌鱼和斑马鱼发育机制的研究取得了较大进展，发现了一些重要的发育相关基因。但是，动物胚胎发育受动态的、网络化的基因调控，还需要做大量的深入、系统的研究。本研究首次克隆了文昌鱼发育相关基因Amph比lef2、Amphi-删C和hadh2的全长oDNA，并对其进行了演绎蛋白特性分析、进化生物学分析及发育表达研究。为了进一步揭示在进化过程中基因功能的变化，我们又克隆了斑马鱼的Z-MRLC和hadh2基因，并与文昌鱼的同源基因进行了比较研究。本研究为揭示文昌鱼、斑

8、马鱼的发育机制及阐明在生物进化过程中基因功能的变化提供了重要资料。通过对青岛文昌鱼的oDNA文库进行大规模测序，发现了一个与其它物种的肌