重组制备人细胞质谷草转氨酶及结晶条件研究

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1、万方数据硕士学位论文重组制备人细胞质谷草转氨酶及结晶条件研究StudiesonRecombinantPreparationandCrystallizationConditionofHumanCytoplasmicGlutamateOxaloacetateTransaminase(GOTl)学号：2131星Q80完成日期：至Q!鱼生垒目墨Q日大连理工大学DalianUniversityofTechnology万方数据大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进

2、行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：重组剑叠厶纽监匮釜堇鳖氢堕狸结晶釜住丑究鼢獬：—j擎卜嘲：旦年』月卫日万方数据大连理工大学硕士学位论文摘要谷草转氨酶(Glutamateoxaloacetatetransaminase，GOT)主要催化L-天

3、冬氨酸和a一酮戊二酸生成L．谷氨酸与草酰乙酸的可逆反应，在生物体内的碳和氮的代谢中扮演着重要角色。谷草转氨酶作为依赖磷酸吡哆醛(Pyridoxal5'-phosphate-dependent，PLP)的酶类，在人体内存在于细胞质和线粒体中，分别称之为GOTI和GOT2。GOTl被证明是维持胰腺癌细胞氧化还原平衡和癌细胞生长所需的谷氨酰胺碳骨架代谢中的关键物质，因此GOTl是抗肿瘤药物的分子靶标，解析GOTI的结构将有助于设计，选择抑制癌细胞生长的药物。(1)GOTl的高纯度重组表达与性质分析通过构

4、建表达载体pET22b．gotl，重组酶在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了可溶性表达。通过HisTrapTMFFcrudecolumn柱层析和HiTrapTMQXL阴离子交换柱层析分离纯化得到了高纯度蛋白。蛋白比活力为70．83U／mg，纯化倍数为133．6倍，活力回收率为18．3％。凝胶排阻色谱表明重组GOTl的聚集形式为二聚体，所形成的二聚体的分子量为66kDa。该酶的最适温度为37。c，最适pH7．5。在35-45oC，及碱性条件下(pH7．5～10。0)，酶的稳定性较好。纯化后的GOTI

5、被Na+、K+和M92+金属离子轻微的抑制，被Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、C02+和Ca2+金属离子显著抑制。(2)GOTl的结晶条件筛选及晶体数据解析初始筛选目的蛋白GOTl的晶体的蛋白浓度为5mg／ml，并确定了三个初筛的条件，分别是CrystalScreen试剂盒的No．9(0．2Mammoniumacetate，0．1MNacitratetribasicdihydratepH5．6，30％w／vPolyethyleneglycol4000)，Index试剂盒的No．42(O．1

6、MBIS．TrispH5．5，20％w／vPEG3350)，Index试剂盒No．43(0．1MBIS．TrispH6．5，25％w／vPEG3350)。经过条件优化，最终确定重组GOTl的结晶最佳条件为0．1MBIS—TrispH6．0，21％w／vPEG3350。GOTl的晶体(PDB登录号：3WZF)通过气相扩散悬滴法获得，结构数据利用X一射线衍射收集。解析后的晶体分辨率为2．99A，晶体属于空间群P43212，晶胞参数为a=93．4A，b=93．4A，c=l07．4A，n亍萨7=900。(

7、3)谷草转氨酶的生物信息学分析虽然二种人来源的细胞质谷草转氨酶在表达载体及结晶条件上采用的方法不同，但二者整体序列的相似度上达95％。晶体3110的100％的残基位于合理允许区域，而晶体3WZF的98．5％的残基位于合理允许区域，其中有6个残基其(p．、I，角出现异常。GOTl和GOT2二者在氨基酸序列上的相似性不到50％，但在三级结构上二者相似度很高。GOTl的活性口袋的关键氨基酸为Gly39，Trp141，Asn195，Arg387，而GOT2的关键氨基万方数据重组制备人细胞质谷草转氨酶及结晶

8、条件研究酸为Gly65，Trp162，Asn215，Arg407。二者催化的活性氨基酸相同，但位置不同。通过进化树分析发现，GOTl与猪来源的、鸡来源的谷草转氨酶在进化上序列较为相似。分子对接分析表明，PLP与GOTl发生了较强的相互所用。底物氨基酸如Asp，Cys及Glu可以与关键氨基酸形成3A以内的氢键，并与该酶产生紧密的结合。关键词：谷草转氨酶；重组表达；蛋白质结晶；结晶条件；序列比对；分子对接万方数据大连理工大学硕士学位论文AbstractGlutamateoxaloace