犬冠状病毒的感染特性及蛋白质组学研究

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1、上海交通大学博士后学位论文犬冠状病毒的感染特性及蛋白质组学研究姓名：王玉燕申请学位级别：博士后专业：生物学指导教师：陆承平20070901上海交通大学论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：日期：年月日上海交通大学论文版权使用授权书本论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家

2、有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本论文属于不保密口。√(请在以上方框内打“√”)论文作者签名：指导教师签名日期：年月日日期：年月日上海交通大学博士后研究工作报告犬冠状病毒的感染特性及蛋白质组学研究摘要1．用A72细胞从经RT-nPCR检测阳性的腹泻犬粪样中分离CCV，经RT-nPCR和免疫荧光试验鉴定，成功分离到4株CCV野毒，分别命名为CCVKM、NJ2、NJl7、SH

3、3。细胞适应性试验表明，分离到的野毒在A72、ST、PK细胞上增殖，KM株可导致A72细胞圆缩、脱落，而HJ2、NJl7、SH3在A72细胞上不产生明显的CPE。参考株CCV1-71及野毒KM、NJ2(第8代)都可在A72、MDCK、FSl、CrFK等细胞上增殖，只有KM株可在Veto细胞上增殖，并可见明显CPE。交叉保护试验证明，抗KM的血清不能中和其他的ccV毒株，抗CCVl-71的血清可以中和野毒KM、NJ2但是不能中和另外的COW野毒株Hc、DF、HF，说明CCV的毒株的交叉保护性很有限。对分离株的部分M基因测序表明，本研究分离的CCVIqJ2、NJl

4、7、SH3与猪传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)的同源性达93．4-97．2％)高于II型猫冠状病毒(FCoV)代表株FIPV79-1683(75．9-79．7％)。而KM在系统进化树上处于I和II型CCV之间，可能是一个新的变异株。2．利用DNA荧光染料Hoechst33258、细胞凋亡检测试荆盒及流式细胞仪技术对CCV分离株及参考毒株CCVl-71、TGEV感染的A72细胞、sT细胞进行了检测，以研究CCV感染对宿主细胞周期的影响。结果发现，在A72细胞上，分离毒株ccVKM、N$2、N儿7和SH3JL乎对细胞的周期没有影响，呈隐性感染状态，而作为对照的CC

5、Vl-71和TGEV可在感染的晚期检测到细胞凋亡现象。在sT细胞上，CCV分离株与TGEV在感染的早期未检测到细胞的凋亡和细胞周期明显改变，但是在感染晚期，可引起宿主细胞的凋亡。流式细胞仪检测结果发现，CCV可引起感染细胞在s期聚集。3．建立了稳定的CCVl-71感染A72细胞体系。利用二雏电泳技术对感染ceVl—7l的A72细胞及同期对照细胞的细胞总蛋白进行分离，对表达有差异的蛋白质进行生物质谱检测(MALDI—TOF—MS或二级串联质谱)分析。结果，48蛋白点与ceV感染有关，其中6个是病毒N蛋白，33个蛋白点的表达上调，9个蛋白点表达下调。本研究在蛋白质

6、的水平上揭示了宿主细胞对感染ccwcj应答。CCV感染后，细胞内的转录翻译活动活跃，多种hnRNP表达上升和翻译延伸因子表达有升有降。同时，细胞启动对病毒感染的应激活动，表现为热休克蛋白、TCPl、硫氧还蛋白及抗过氧化蛋白等分子伴侣蛋白表达上调。腺苷酸环化酶降低，而丝氨酸／犬冠状病毒的感染特性及蛋白质组学研究苏氨酸受体相关蛋白表达上升，说明细胞内信号转导活动改变。在感染晚期细胞凋亡机制被启动，凋亡蛋白通过26S蛋白酶体被降解。骨架蛋白TUBB、绒毛蛋白和微管交联因子等降低，细胞的骨架结构受到破坏。同时也启动了细胞骨架的维修活动。首次证明在感染宿主细胞内ccwg

7、N蛋白有六种分子形式，可能分别执行不同的生物功能。上海交通大学博士后研究工作报告INFECTIoNCHARACTERANDPRoTEoMICSAPPRoACHToCANINECoRoNAⅥRUSINFECTEDHOSTCELLSABSTRACT1．FourCCVwildstrainsworeisolatedfromCCVpositivediarrheadogfesesbvCCVsusceptivelycelllineA72cell，andidentifiedbyIi=IⅥCRandimmunofluorescencetests，namelyCCV幻吐CCVNJ

8、2，CCVNJl7andCCVSH3．