海参内脏丝氨酸蛋白酶的研究

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1、囊萎夫学硕士学位论文海参内脏丝氨酸蛋白酶的研究StudyonSerineProteinasefromtheVisceraofSeaCucumber(Stichopusjaponicus)论文答辩日期：至Q呈垒生鱼且§旦学术诚信声明IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlY2631616兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过韵研究成果。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人(签名

2、)：每五乙时间：w，略6喜形日保护知识产权声明本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影Ell、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。今_7作者(签名)：儆龙乏铷滏名泓杨{j、时间：阳件车多真巧固。海参内脏丝氨酸蛋白酶的研究摘要海参(Seacucumber，holothurians)作为一种传统的海珍品，在中国、日本、韩国等亚洲国家，深受人们的喜

3、爱。为了满足消费者的需求，我国海参的产量都在逐年递增。但是，海参在运输和加工过程极其容易出现一个严重问题——自溶。自溶是一种常见的现象，经常发生在各种各样的水产品中。动物死后，合成代谢被迫停止，而内源性蛋白酶仍然具有活性，并参与分解代谢作用。消化器官中分泌多种内源性蛋白酶，比如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶等。在这些蛋白酶中，丝氨酸蛋白酶对胶原蛋白具有显著的降解活性。在海参的食用部分中，难溶解的胶原蛋白纤维占总蛋白的70％。因此，胶原蛋白的降解是海参自溶的主要原因。针对捕捞后的海参很容易发生自溶

4、，推测海参内脏中存在一种未知蛋白酶可能对胶原的降解起重要的作用。利用胶原蛋白作为底物，分析海参内脏中分解胶原蛋白的主要蛋白酶。结果显示，丝氨酸蛋白酶可以强烈降解胶原蛋白。因此，推测海参内脏中的丝氨酸蛋白酶参与海参的自溶。本研究通过DEAE．Sephacel阴离子交换层析、SepharcylS-200分子筛层析、Mini．Q强阴离子交换层析等方法，首次从海参内脏中分离纯化得到一种丝氨酸蛋白酶，回收率为1．6％，纯化倍数为331．7倍。SDS．PAGE电泳和明胶酶谱分析表明，该酶的分子量约为34kDa。

5、此外，通过肽质量指纹图谱分析得到6个片段共l11个氨基酸残基，该序列与刺参肠道中枯草杆菌蛋白酶前蛋白转化酶(proproteinconvertasesubtilisin／kexintype9prepropro．tein)序列相似性为100％，进一步确定该酶为丝氨酸蛋白酶。通过荧光底物法和明胶酶谱检测分析，发现该酶的最适pH为6．0～9．0，在35"--'40。C之间表现出较高的分解活性。同时，丝氨酸蛋白酶抑制剂benzamidine和PefablocSC均能够强烈抑制该酶活力，而且其他蛋白酶抑制剂(

6、E．64、EDTA、Chymostatin、PepstatinA)均不起抑制作用，表明该酶为丝氨酸蛋白酶。研究纯化的丝氨酸蛋白酶与胶原蛋白作用关系中发现，该酶在37oC和4oC均可以有效降解海参体壁胶原蛋白。值得注意的是在37oC孵育15min后，胶原结构中主要两条链(13链和丫链)被完全降解，37oC孵育3h后，胶原三条链均被该酶完全降解。然而，在丝氨酸蛋白酶类抑制剂存在下，该酶降解胶原蛋白的现象就被完全抑制，半胱氨酸蛋白酶类抑制剂(E_64)、金属蛋白酶类(EDTA)、天冬氨基酸蛋白酶类抑制剂(

7、PepstatinA)并没有显示出抑制该酶降解胶原的效果。由此可见，纯化的丝氨酸蛋白酶在海参自溶过程中参与胶原蛋白的降解，是海参自溶过程中起关键作用的重要蛋白酶。关键词海参内脏，丝氨酸蛋白酶，分离纯化，性质分析，自溶StudyonSerineProteinasefromtheVisceraofSeaCucumber(StichopusjaponicAbstractSeacucumber(Stichopusjaponicus)istraditionallyregardedasaseafooddelic

8、acyandiswidelyconsumedinChina，Japan，KoreaandotherAsiancountries．InChina，thetotaloutputofseacucumberproductionisincreasingannuallytomeetconsumerdemand。However,seacucumbersareeasilysubjecttoautolysis，whichisamajorproblemintransportationan