ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶与恶性血液疾病的研究

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：委歪l螅日期：印耻S‘苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相-

2、一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。一涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：壹歪!煎El导师签名：剑期：螋、毒舌lI型跨膜丝氨酸蛋白酶与恶性血液疾病的研究中文摘要目的：II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TypeIITransmembran

3、eSerineProteases，TTSPs)是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的丝氨酸蛋白酶，在哺乳动物的许多生物学过程中扮演着重要角色，其功能异常可导致癌症、缺铁性贫血、耳聋、心血管疾病等。在人类，TTSPs共有17个成员，其中研究比较广泛的matriptase在正常生理、病理及肿瘤中起着广泛而重要的作用，但是它在恶性血液疾病如慢性淋巴细胞白血病(ChronicLymphocyticLeukemia，CLL)中的生物学功能目前尚无相关报道。本研究旨在探讨II型跨膜丝氨酸蛋白酶在恶性血液疾病细胞中的表达。基于前期研究结果

4、，我们以matriptase作为重点研究对象，深入探讨matriptase在CLL中的作用及机制，为进一步研究II型跨膜丝氨酸蛋白酶的功能以及它们在恶性血液疾病发生发展中的作用提供依据。方法：(1)利用逆转录聚合酶链式反应(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)技术对人恶性血液病细胞系和恶性血液病患者骨髓细胞中17种TTSPsmRNA的表达进行分析；(2)实时定量PCR(Quantitativereal．timePCR，qRT-PCR)检测白血病患者骨髓细胞中matriptase及其内源性特异性抑制剂肝细

5、胞生长因子激活物抑制剂1(Hepatocytegrowthfactoractivatorinhibitor一1，HAI．1)mRNA的表达；(3)Westernblot检测恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中matriptase蛋白的表达；(4)流式细胞术和免疫荧光染色检测Namalwa细胞系和CLL患者骨髓细胞中matriptase蛋白的表达及定位，以正常人外周血(Normalperipheralblood，NPB)白细胞作对照；(5)利用磷酸钙沉淀法制备慢病毒，并转导B细胞来源的淋巴瘤细胞系Namalwa用于干扰matri

6、ptasemRNA的表达，qRT-PCR和Westernblot技术检测干扰效率；(6)基底膜侵袭实验(TranswellInvasionAssay)检测matriptase表达下调后及matriptase特异性抑制剂HAI．1作用后肿瘤细胞侵袭能力的改变；!!!茎塑蔓一．一II型跨膜丝氨酸蛋白酶与恶性血液疾病的研究———————————————————————————————————————————————————————一-：：：：：：：：：：：：=：：：：(7)细胞迁移实验(TranswellMigrationAssay)

7、检测HAI．1作用后肿瘤细胞迁移能力的改变；(8)细胞增殖实验(CellCountingKit．8，CCK．8)检测HAI．1作用后肿瘤细胞增殖能力的影响。结果：(1)采用RT-PCR技术对15种人恶性血液病细胞系和81例恶性血液病患者骨髓细胞中17种TTSPsmRNA的表达进行分析，发现matriptase、HATL4、polyserase-1等TTSPsmRNA在某些恶性血液病细胞系或白血病患者骨髓细胞中特异性高表达，如matfiptasemRNA在B细胞来源的淋巴瘤细胞系(Namalwa和Raji)和CLL患者骨髓细胞中表

8、达特异性增高，而在其它恶性血液病细胞系或白血病骨髓患者细胞中基本检测不到表达；HATL4mRNA在急性髓系白血病(AcuteMyelocyticLeukemia，AML)患者骨髓细胞中表达特异性增高，而在其它白血病患者骨髓细胞中基本检测不到表达。我们以在慢性淋巴