crisprcas系统诱导的哺乳动物细胞基因组突变及相关检测方法比较

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1、ANewMethodBasedonqPCRHighResolutionMeltingSystemtoDetectCRISPR／CasSysteminducedMammalGenomicMutationThesisSubmiRedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByWangkunSupervisor：Prof．CaoGengshengDate：June，

2、2014关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。学位申请人(学位论文作者)签名：201／-t-铽月眵日关于

3、学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文(纸质文本和电子文本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文(纸质文本和电子文本)。，(涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书)学位获得者(学位论文作者)签名：学位论文指导教师签名：201／?-盔r-]

4、-月1莎年够讲2妙摘要现在的生物科学已经进入了后基因组时代，其主要任务就是通过生物信息学分析大量新基因的功能，揭示某些基因在动物／人体发育过程，以及疾病发生过程的重要作用。基因组编辑能准确定位，且稳定的改造基因组遗传物质。作为一种理想的生物遗传物质的编辑方法，该技术不论是在基础科研还是实际应用中都有着广阔的前景，它使人们能够按照自己的设想去改造并建立稳定遗传的模型，同时为疑难杂症的解决提供了一定的解决方案。近年来基因组编辑的方法发展较快，到目前为止有三种方法，包括ZFN系统，TALEN系统，CRISPR／Cas9定点剪切

5、系统。相比之下，前两个系统有一定的弊端，识别效率低，打靶效果不明显，操作复杂，而最近兴起的Cas9系统不仅构建方法简单，同时拥有着高效的打靶效率，而且可以同时打靶多个位点。本实验则利用Cas9系统，通过构建人293T细胞的打靶载体，实现基因的定点敲除，高效率的获得突变的细胞。并且通过多种手段，包括AFLP检测打靶位点的完整性，Surveyor法检测打靶的成功率，以及HRM高分辨率熔解曲线分析不同基因的打靶效率一方面来验证Cas9系统的打靶效率，另一方面寻找一种快捷，方便的突变检测手段。实验结果表明相比经典的突变检测技术，

6、HRM检测技术似乎更加效率和精确，通过设计片段的PCR即能检测基因打靶的效率，更加经济适用，而且有着PCR实验的所有优点，高效率，高通量，高稳定性。CRISPR／Cas系统的定点突变效率较高，大约能到40％，相比ZFN以及TALEN技术有着明显的优势，快速高效的系统更利于我们进行基因敲除的操作，也是将来实验过程中基因组编辑技术的主要手段。同时实验中独特的gRNA的构建也是本实验中的创新之处，实验中通过一对匹配靶位点的Oligo退火，同时利用之前构建好的gRNA的5’和3’端进行PCR获得455bp的功能性gRNA片段，大

7、大降低了之前gRNA构建的成本，也相应的提高了实验效率，并且结果通过了分子生物的检测，与文献中报道的gRNA功能并无差异。关键词：基因组编辑，Cas9系统，高分辨率熔解曲线HRM，gRNA构建AbstractThemaintaskofbiologyscienceistoexploremorefunctionsoflargeamountsofnewgene，revealtheimportanceofafewgenesinvovledinthedevelopmentanddiseaseinhumanandanimal，ont

8、hetrainofsciencedevelopmentwhobornbioinformatics，inpost-genomicera．Asaidealwaytomodifygenome，genomeeditingCanlocateandalterchromosomestablely,notonlyallowspeop