慢病毒介导的mtor靶向抑制对肺腺癌a549细胞生物学功能的影响

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMaster(doctor)DownRegulationOfmTORByLentiviralsContributesToApoptosisandinhibitsCellProliferationInLungCancerByLijunMiaoSupervisor：Prof．JingWangIntemalMedicineTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2012原创性声明Irllllllrlllll

2、lliIiplllllllllillUIY2313087本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位敝憾积日期：矽／缉j’月y名学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部

3、或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：勺锄日期五尸fz，年j～月7∥日中文摘要慢病毒介导的roTOR靶向抑制对肺腺癌A549细胞生物学功能的影响博士研究生：苗丽君导师：王静教授郑州大学第一附属医院呼吸科河南省临床医学重点开放实验室郑州450052摘要1目的肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，近年来肺癌的发病率和病死率均迅速上升，其中男性患者中肺癌的死亡率已居首位。其中非小细胞肺癌的发病率在所有肺癌中比

4、例最高。肺癌的发生及发展与肿瘤相关基因的异常表达存在着密切的关系。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)作为一种高度保守的蛋白激酶，可以通过整合生长因子和营养信号来调节肿瘤细胞生长，是肿瘤生物调节中的关键性基因。目前mTOR已成为肿瘤治疗的生物靶点。慢病毒介导的RNA干扰是目前公认的最有效的基因沉默手段之一。本文拟通过利用慢病毒介导的RNA干扰技术，以非小细胞肺癌细胞A549为研究对象，以mTOR为目的靶基因。利用MTT、流式细胞术、克隆形成、Transwell及裸鼠体内试验等技术，分别在体外及体内环境中探讨降低mTOR的表达对A549细

5、胞生物学行为的影响。此外通过检测P70S6K，MTl．MMP，HIF．1a，VEGFA，cyclinDl等基因的表达变化，进一步分析mTOR调控肿瘤生物学功能的分子机制。本研究旨在通过以上实验探讨mTOR在肺癌细胞中的作用及其机理，同时为mTOR作为治疗性靶基因在临床方面的应用、为肺癌的基因治疗、基因药物的研制提中文摘要供必要的实验依据。2方法2．1根据mTOR编码区基因序列，设计合成4条shRNA，并克隆到慢病毒表达载体。转染A549细胞后，应用RT．PCR及westernblot检测其干扰效果，并确定干扰效率最好的一条shRNA。最后分别将其包装成带有GFP标签及Puro抗性基因的慢

6、病毒颗粒。2．2体外实验中，将带有GFP绿色荧光标签的慢病毒感染A549细胞。应用MTT、细胞生长曲线、克隆形成、流式细胞术检测A549细胞的增殖和凋亡能力；应用transwell检测细胞侵袭能力；利用westernblot检测mTOR的表达降低对P70S6K，MTl．MMP，HIF．1a，VEGFA，cyclinDl蛋白表达的影响。2．3体内实验中，利用带有Puro抗性基因的慢病毒感染A549细胞并获得持续表达mTORshRNA及对照病毒的稳定细胞株。将获得的稳定细胞株扩增并以107／只的细胞浓度接种裸鼠。接种后对裸鼠的体重及肿瘤形成进行监测，分析mTOR的低表达对A549细胞成瘤性的

7、影响。2．4统计学处理：应用SPSS16．0统计分析软件进行统计学处理，计量资料采用均数4-标准差IX±sl表示，多样本均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD比较，率的比较采用F检验等进行统计学处理，显著性检验水准取et=0．05。3结果3．1成功将四条mTORshRNA克隆至pSIHl．H1．copGFP慢病毒克隆载体，分别为Sh．mTOR一6506，’Sh．mTOR．3266，Sh．mTOR．4995，Sh．mTOR．6216