巴西松子蛋白酶分离纯化及蛋白质提取

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1、浙江大学硕士学位论文巴西松子蛋白酶分离纯化及蛋白质提取姓名：肖丽申请学位级别：硕士专业：食品工程指导教师：应铁进2012-04逝婆盘堂亟±堂焦途塞

2、lHHIIIIIIIIlUlIlJlllJ黑Y2269432摘要为进一步了解松子的品质衰变机制，延长保质期，充分开发利用松子资源，满足食品及医药等领域对松子品质的较高需求，本试验以巴西松子(PinusgerardianaWall．)为试验原料，对松子中蛋白酶的分离纯化、酶学性质、松子蛋白质的提取条件等方面进行了初步研究，主要内容如下：(1)通过利用重蒸水、乳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和riffs．HCl缓冲

3、液等5种常用浸提溶剂提取蛋白酶，探讨不同的提取溶剂对酶活力的影响程度，实验得出提取效果为硼酸．硼砂盐缓冲液>Tris．HCl缓冲液>磷酸盐缓冲液>gL酸盐缓冲液>蒸馏水，以硼酸盐缓冲液的提取效果最好。进一步对pH、提取时间和料液比进行单因素试验，在单因素试验基础上，进行正交试验进一步确定最佳工艺参数。以提取时间、缓冲液pH和料液比为试验因素，进行3因素3水平正交试验，得出提取巴西松子蛋白酶的最佳工艺参数为pH9．0的硼酸．硼砂缓冲液中以料液比为1：8、提取60min。(2)利用硫酸铵沉淀结合离子交换柱层析的方法对松子中所含的蛋白酶进行分离提纯，以获得试验所需高纯度

4、酶。盐析分级沉淀结果表明，当硫酸铵饱和度小于20％时，上清液中酶活力跟原液相差不大。当硫酸铵饱和度为80％时，上清液中几乎检测不到酶活，即80％(NI-h)2S04饱和度可有效沉淀目标蛋白酶。DEAE．SepharoseFF阴离子交换柱层析纯化效果较为理想，使蛋白酶比活力提高到了8．61倍，回收率为21．65％。对纯化的蛋白酶进行电泳分析，结果表明上述方法分离纯化效果良好，洗脱物仅出现一个活性峰。(3)十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS．PAGE)分析表明，松子中蛋白酶相对分子质量为33000Da。采用SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示单一条带，表明其纯

5、度已达到电泳纯。通过测定温度对蛋白酶酶活力的影响，可知该酶最高耐热温度为50℃，耐热性较差。最适温度试验结果表明，该蛋白酶的最适反应温度为50。C。巴西松子蛋白酶最适pH为9．0，该酶属于碱性蛋白酶。通过测定金属离子对酶活力的影响可知，Na+和K+对该蛋白酶活性有轻微激活作用，Mnz+的促进作用最强，而Ca2十和M92十对酶活性有较弱的抑制作用，几乎可以忽略不计，Cu2十的抑制效果最强为25．19％。因此，该酶是Mn2+激活蛋白酶。(4)以脱脂松子粉为原料，硼砂．硼酸盐缓冲液为提取液，研究碱性蛋白酶提取松子蛋白的工艺条件。以松子蛋白提取率为指标，考察了pH、提取温

6、度、提取时间、加酶量和料液比5个单因素对松子蛋白提取率的影响。在单因素实验基础上，通过响应面法(RSM)优化了提取工艺条件。结果表明，提取时间、加酶量和料液比对松子蛋白提取率影响较大；优化的松子蛋白提取工艺条件为：提取时间62．20min，加酶量O．99％，料液比1：52．30，此时蛋白的理论提取率是74．13％。在优化工艺条件下，松子蛋白的提取率达71．44％。关键词：巴西松子：蛋白酶；分离纯化；SDS．PAGE；酶学性质：蛋白质IIAbstractInthispaper,theseparation，purificationandenzymeproperties

7、ofaproteasefromChilgozapinenut，anditsproteinextractionconditionswerepreliminarystudiedinordertofullyutilizepinenutsresources，meettheneedsofthefoodandpharmaceuticalindustriesforhigherqualityofpinenuts，andfurtherunderstandingthedeteriorationmechanismofChilgozapinenut，SOastoextenditsshel

8、flife．Themainresultswereasfollows：(1)Theeffectsofdifferentextractionsolventsontheenzymeactivitywasinvestigatedthroughtheuseofdistilledwater,lactatebuffer,phosphatebuffer,boratebufferandTris—HClbuffer,whicharecommonlyusedtoextracteprotease．Theexperimentalresultsshowedthattheextractionr

9、ateby