蛋白质提取及纯化.doc

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1、此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除蛋白质提取及纯化提取蛋白质的当天早晨去后把高速离心机和超高速离心机都打开冷却1、前一天晚上用ResuspensionBuffer重悬4L菌体，然后离心于4C保存，第二天使用。2、用少量预冷的ResuspensionBuffer重悬细菌，1proteaseinhibitortablets(EDTAFree)，1mMPMSF,然后用玻璃Homogenizer做均一化处理，将总体积调至80ml；3、HighPressureHomogenizer破壁，特别注意样品一定要在不加压力的情况下运行一个循环（2min）；然后1200bar

2、，6min三个循环，整个过程冰水冷却；4、DNaseI处理：加入2.5mgDNaseI，10mMMgCl2,室温处理30min；5、11.000rpm，4℃，15min;then11.000rpm，4℃，15min；6、1mMPMSF,45.000rpm，4℃，90min;7、用ResuspensionBuffer洗两次以除去可溶性的蛋白质，然后预热分光光度计；8、用3-4mlBindingBuffer重悬Membranepellets，动作一定要轻缓，重悬后的总体积不超过8ml，取出300ul测定OD800和OD850(以OD850为准),测定时候是逐步稀释，每

3、次吸光值小于1；9、调整OD850≤30-50，在缓慢搅拌（速度一定要慢）的情况下逐滴加入30%的LDAO使其终浓度达到0.5%，1mMPMSF，26℃黑暗条件下重悬1h，期间注意观察颜色变化；10、45.000rpm,4℃,30min，注意观察颜色的变化以及沉淀是否发生明显的变化。ChargeandEquilibrateResin(1)用蒸馏水冲洗柱子以除去20%酒精，注意不要用buffer，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；(2)用0.1MNiSO4ChargeResin，1ml/min，10倍柱体积，尽量使得紫外吸收和电导稳定；(3)用蒸馏水冲洗，1ml

4、/min，至紫外吸收和电导稳定；(4)用bindingbuffer洗柱子，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；9、收集上清，0.22um滤膜过滤，取出200ul总蛋白分装保存，10、上样：0.5ml/min（循环上样2次）；此文档仅供学习与交流此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除11、洗脱：先用bindingbuffer，流速1ml/min；然后用WashBuffer，1ml/min，最大限度地去除杂蛋白，最后用EluteBuffer洗目的蛋白，1ml/min。12、超滤：一半直接超滤后用重悬bindingbuffer重悬，液氮速冻后-80C保存13、st

5、ripbuffer螯合，20%酒精，4C放置。Buffer（1）ResuspensionBuffer:20mMTris-HClpH8.0,100mMNaCl,passthrough0.45umfilter（2）BindingBuffer:20mMTris-HClpH8.0,100mMNaCl,10mMImidazole,0.1%LDAO（3）WashBuffer:20mMTris-HClpH8.0,100mMNaCl,20mMImidazole,0.1%LDAO（4）ElutionBuffer:20mMTris-HClpH8.0,100mMNaCl,500mMIm

6、idazole,0.1%LDAO（5）ChargeBuffer :0.1MNiSO4（6）StripBuffer :20mMTris-HClpH8.0,100mMNaCl,50mMEDTA此文档仅供学习与交流